[发明专利]致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原微生物的检测试剂盒及检测方法，尤其涉及食品中致泻性大肠埃希氏菌mPCR-DHPLC检出试剂盒及方法。

背景技术

致泻性大肠埃希氏菌是与人类疾病有关的大肠杆菌的统称，包括肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli，EIEC)等。致泻性大肠杆菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的主要致病菌，其中尤以EPEC、ETEC所占比例为大。多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性。EHEC O157：H7已被世界卫生组织(WHO)定为新的食源性致病菌，其引发的出血性肠炎的暴发或散发病例，自1983年以来在北美州(美国、加拿大)地区逐年增多，英国、日本亦有爆发和散发病例报道，我国也发现散发病例，尚未有爆发EHEC的报道。

目前，我国对大肠杆菌的诊断和流行病学调查也主要仍依靠菌株血清型的菌体抗原进行鉴定，但血清学分型检测有其弊端：检测周期长并易受人为因素干扰，在一些不同的“O”血清型之间存在着交叉反应，而且多数从腹泻病人粪便标本中分离出的大肠杆菌并不能用现有的血清抗原进行诊断鉴定。因而在许多临床实验室中，仍将未能鉴定的大肠杆菌作为肠道正常菌群看待，仅根据少数生化指标，甚至仅根据乳糖发酵一项就将分离物作为“杂菌”丢弃，从而殆误诊断和治疗的例子屡见不鲜。现在国内关于致病性大肠杆菌的国家标准(GB/T4789.6-2003)和行业标准检测方法还是传统的微生物学检测方法，尚不够完善，四种致泻性大肠杆菌的分类鉴定仅依靠血清学凝集反应现象，而很多情况下肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌容易出现血清学的交叉反应，很难进行区分。而国外的传统微生物检测方法(如FDA、AOAC、ISO等)也是以单一的或少数目标菌为目的设计的程序，既费时又费力。目前，有些成熟的微生物快速鉴定系统已经被应用于致泻性大肠杆菌的检测，但是开发较多的也仅限于肠出血性大肠杆菌O157:H7。如荧光免疫检测法(VIDAS)、BAX全自动病原菌筛选系统、API20E等。在分子生物学检测方面，目前FDA2004标准仍是以检测一种致泻性大肠杆菌为目的设计程序，检测不同的致泻性大肠杆菌需要不同的反应条件。因此，建立高效、快捷、高通量的致泻性大肠埃希氏菌分型鉴定技术是食品安全所面临的急需解决的问题。

变性高效液相色谱(DHPLC)采用离子对反相高效液相色谱的原理，是通过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离的方法，因此，也有人称该技术为温度调控离子对反相高效液相色谱。该技术的发明为生命科学领域里的核酸分析提供了方便实用的技术平台。其快速高通量、全自动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。DHPLC技术检测微生物是很好的培养不依赖的混合微生物样本的分析平台，不仅能鉴定常见的微生物，还能鉴定不常见的，苛刻的，和厌氧的细菌。该技术在已知和未知基因突变的检测和筛选、基因分型、基因定量和长度多态性分析等领域已经得到广泛应用。

基于此，本发明人试图建立利用DHPLC的高效、快捷、简便的适宜临床检测应用的特异而灵敏的致泻性大肠埃希氏菌的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于灵敏快捷地检测样品、尤其是检测食品中致泻性大肠埃希氏菌以判定待检样品是否受到污染的试剂盒及其检测方法。

首先，本发明所述的致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒是：

1mL检测溶液含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、Taq DNA聚合酶5000U(即5U/μL)及四种致泻性大肠埃希氏菌引物对各10μM；

其中，针对四种致泻性大肠埃希氏菌的目的基因及特异性引物序列如下：

本发明还提供了利用上述试剂盒检测致泻性大肠埃希氏菌的检测方法，包括如下步骤：

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；