[发明专利]致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1、致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒，其特征在于：

1mL检测溶液含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及四种致泻性大肠埃希氏菌引物对各10μM；

其中，致泻性大肠埃希氏菌的特异性引物序列如下：

2、致泻性大肠埃希氏菌的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤：

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min；

②DHPLC分析：色谱柱：PS-DVB & C18DNASep色谱柱(4.6mm×50mm，粒度3μm)；柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B；

                0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B；

                3.6min，41.8％缓冲溶液A，58.2％缓冲溶液B；

                6.8min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B；

                9.9min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B；

                13min，35.0％缓冲溶液A，65.0％缓冲溶液B；

其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器(光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s)；

上样量：PCR产物5μL。