[发明专利]饲料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及饲料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及利用PCR-DHPLC技术进行检测的检测方法及所使用的试剂。 

背景技术

动物源性饲料产品极易受到微生物污染，并随后污染畜禽产品，再通过食物链引发人类疾病。动物源性饲料产品如果来自疫区带菌、病死畜禽或未经严格消毒加工的副产品原料，常会造成动物疫病扩散和通过食物链导致人类患病。某些致病性和相对致病性细菌也可引起畜禽细菌性饲料中毒。微生物污染饲料是人畜共患传染病传播的重要途径。微生物污染危害的评价指标通常主要有细菌总数、大肠菌群、致病菌和霉菌。常见的致病菌主要是指肠道致病菌(如沙门氏菌、志贺氏菌等)。饲料安全卫生标准中一般对致病菌都做出“不得检出”的规定，以确保饲料的安全卫生。 

传统检测方法中，细菌培养和鉴定是一项既耗时又复杂的工作，由于某些生化试剂、血清等质量不稳定、特异性不好等因素，经常给鉴定的结果带来差异。目前国内外针对沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测方法很多，如：PCR-凝胶电泳法、实时荧光PCR法、基因芯片测试法、全自动细菌生化鉴定仪等，此外针对沙门氏菌的还有荧光免疫检测法(VIDAS)、胶体金免疫测试条等。尽管方法众多，但各种方法都存在各自的优势和缺点：培养生化鉴定法受人为和试剂影响因素较大；细菌的自动生化鉴定仪器重现性较好，但由于只是局限在几个生化反应，相似的菌株间鉴别特别困难；荧光免疫检测法(VIDAS)检测成本极高，且存在着假性结果的问题；PCR-凝胶电泳检测技术虽然检测成本低，但存在着反应产物后处理极易造成污染的缺点；实时荧光PCR技术具有特异性强，灵敏度高等优势，但却存在着检测成本较高，荧光探针保存时间较短等不足；而基因芯片方法则缺乏实用性。 

实际检测中，对沙门氏菌、志贺氏菌检测时，由于该两种菌检验所用的增菌液不同，即使是对同一份标本也只能分别增菌，分别划线分离，分别鉴定， 使实验室的工作量成倍增加，同时由于两者增菌时间不相同，沙门氏菌18～24h，志贺氏菌6～8h，给检验工作安排带来相当大困难。鉴于此，本发明的发明人认为极有必要开发一种新的检测方法，以高效、快速、灵敏地地检测待测样品的沙门氏菌、志贺氏菌的染菌情况。 

发明内容

本发明首先提供用于同时快速检测饲料中沙门氏菌和志贺氏菌的基于mPCR-DHPLC检测的试剂盒。 

本发明所述的试剂盒中包括一种检测溶液，该检测溶液中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及沙门氏菌和志贺氏菌引物对各10μM； 

其中，沙门氏菌和志贺氏菌的特异性引物序列如下： 

本发明还提供了利用上述试剂盒检测饲料中沙门氏菌和志贺氏菌的mPCR-DHPLC方法，包括如下步骤： 

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增： 

预变性：94℃，3min； 

进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环； 

终止延伸：72℃，7min； 

②将PCR扩增产物进行DHPLC分析： 

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm； 

柱温：50℃； 

流动相(体积比)：0.0min，48.0％缓冲溶液A，52.0％缓冲溶液B； 

                0.5min，42.9％缓冲溶液A，57.1％缓冲溶液B； 

                3.6min，38.8％缓冲溶液A，61.2％缓冲溶液B； 

               6.8min，36.6％缓冲溶液A，63.4％缓冲溶液B； 

               9.9min，35.2％缓冲溶液A，64.8％缓冲溶液B； 

               13min，34.3％缓冲溶液A，65.7％缓冲溶液B； 

其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液； 

流速：0.9mL/min；