[发明专利]饲料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.饲料中沙门氏菌和志贺氏菌的检测方法，其特征在于使用试剂盒，所述 试剂盒中包括一种检测溶液，该检测溶液中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM  MgCl₂、dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及沙 门氏菌和志贺氏菌引物对各10μM；其中，沙门氏菌和志贺氏菌的特异性引物 序列如下：

所述检测方法包括如下步骤：

①取1μL待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液和14μL灭 菌超纯水，总体积25μL；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min；

②将PCR扩增产物进行DHPLC分析：

色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，48.0％缓冲溶液A，52.0％缓冲溶液B；

0.5min，42.9％缓冲溶液A，57.1％缓冲溶液B；

3.6min，38.8％缓冲溶液A，61.2％缓冲溶液B；

6.8min，36.6％缓冲溶液A，63.4％缓冲溶液B；

9.9min，35.2％缓冲溶液A，64.8％缓冲溶液B；

13min，34.3％缓冲溶液A，65.7％缓冲溶液B；

其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为 0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射 谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL。