[发明专利]一种快速的利用基因重组酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法，特别涉及到的是一种快速的利用基因重组酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法。

背景技术：

朊病毒是一类能在动物和人中引起可传染性脑病(包括疯牛病、羊搔痒症、库鲁病、克雅氏病等)的病原体，其高度传染性和致死性对整个社会造成了极大的危害。关于朊病毒的分子致病机理和治疗药物筛选、开发的研究是国际上生物学、医学领域研究的前沿和热点。全世界的研究者们正致力于寻求抗朊病毒药物筛选的细胞模型的研究，从而尽快研发出预防和治疗朊病毒引发疾病的药物。而目前在美国和欧洲有关抗朊病毒药物的研发领域中，主要利用动物细胞模型药物抗朊病毒的药物。但是这个筛选系统的技术上的复杂性，只能局限在少数化合物中进行；更重要的是，由于这个筛选系统的实验成本过于昂贵，又具有哺乳类动物内朊病毒交叉传染的危险性，需要P3级以上的无菌实验室和大量的高级技术人员的工作才能保证药物筛选的进行，使得大规模的在已知化合物的范畴内筛选抗朊病毒药物缺乏实用的可能性。目前，有研究表明建立在酵母细胞上的抗朊病毒药物筛选模型完全可以取代动物细胞模型，而且在操作的安全性上有强大的保障。但是以野生型酵母细胞为模型，为大规模筛选抗哺乳动物朊病毒的药物提供候选药物存在着缺陷和不足：由于利用野生型酵母的颜色表现型来判断药物的抗朊病毒效果，酵母细胞的颜色变化需要在药物处理后涂在1/2YPD的固体培养基上，置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天后才能明显确定，这使得药物筛选的时间过长，不利于快速、大量的药物筛选，并且颜色判断存在人为差异，误差较大。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明的目的在于通过基因重组野生型酵母细胞[PSI⁺]内SUP35基因，导入荧光标签GFP基因，利用荧光显微镜在细胞水平快速地筛选抗朊病毒药物。

本发明的技术方案是基于分子水平的朊病毒的致病机理，通过细胞内荧光标签GFP在SUP35的N和M结构域中间的插入，而不影响朊病毒的聚集及传播，利用基因重组技术改造了野生型酵母细胞，解决了原有的酵母细胞模型在药物筛选过程中筛选速度慢的缺陷。

本发明使用的菌种为野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)，来自于美国标准菌种库(American Type Culture Collection，ATCC)，保藏编号为208719。这种野生型酿酒酵母细胞带有[PSI⁺]朊病毒，固体菌落颜色为白色。

本发明采用的技术方案是：一种快速的利用基因重组酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法，步骤如下：

1)[GPSI⁺]酵母细胞的制备：

在野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)内的朊病毒[PSI⁺]的编码基因SUP35上，将荧光标签GFP基因插在N和M结构域中间，使基因编码的Sup35p由NMC转变为NGMC，得到荧光标记[PSI⁺]朊病毒的[GPSI⁺]酵母细胞，其菌落颜色显浅粉色；即：利用分子生物学上的基因操作技术，在酵母细胞的SUP35基因的编码区的123位密码子和124位密码子中插入编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因，得到含有荧光标签(Sup35-GFP)的酵母细胞。

2)筛选抗朊病毒药物：

[GPSI⁺]酵母细胞的活化：取[GPSI⁺]酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30℃振荡过夜培养；

[GPSI⁺]酵母细胞初始OD值的调试：调制[GPSI⁺]酵母细胞悬液OD₆₀₀＝0.5；

筛选待测药物：取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以及调试好的[GPSI⁺]酵母细胞悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞放入新的装有1/2YPD培养液和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1～5天；

检测：用荧光显微镜，定量观察[GPSI⁺]酵母细胞。

朊病毒被治愈的细胞中荧光呈可溶状态，并分布于整个细胞，未被治愈的细胞中荧光聚集在一起形成焦点。通过细胞中的荧光焦点，可以直观快速的检测出待测药物对朊病毒聚集体的作用效果。