[发明专利]3-氨基酪氨酸遗传掺入还原酶

权利要求书

1.一种重组还原酶，其包含3-氨基酪氨酸(NH₂Y)残基。

2.如权利要求1所述的重组还原酶，其特征在于，所述还原酶是核糖核苷酸还原酶。

3.如权利要求1所述的重组还原酶，其特征在于，所述还原酶是I类或IV类核糖核苷酸还原酶。

4.如权利要求1所述的重组还原酶，其特征在于，所述还原酶衍生自大肠杆菌核糖核苷酸还原酶。

5.如权利要求1所述的重组还原酶，其特征在于，所述重组还原酶是衍生自人核糖核苷酸还原酶、小鼠核糖核苷酸还原酶、酵母菌核糖核苷酸还原酶或单纯疱疹病毒核糖核苷酸还原酶的重组还原酶。

6.如权利要求1所述的重组还原酶，其特征在于，所述还原酶是在以下一处或多处包含NH₂Y突变的大肠杆菌核糖核苷酸还原酶：

(a)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚单位的Y₇₃₀；

(b)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚单位的Y₇₃₁；

(c)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的β2亚单位的Y₁₂₂；或

(d)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的β2亚单位的Y₃₅₆。

7.一种细胞，其包含：

衍生自编码还原酶的一条或多条多肽链的还原酶核酸的重组核酸，所述重组核酸包含选择者密码子；

该细胞还包含正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)和识别该选择者密码子的正交tRNA(O-tRNA)，其中该O-RS用3-氨基酪氨酸优先氨酰化该O-tRNA。

8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述核酸编码与I类或IV类核糖核苷酸还原酶的多肽链同源的一条或多条多肽链。

9.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述还原酶衍生自大肠杆菌核糖核苷酸还原酶。

10.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含3-氨基酪氨酸。

11.一种重组还原酶的细胞浆液或提取物，所述重组还原酶包含3-氨基酪氨酸(NH₂Y)残基，其中所述细胞浆液或提取物包含至少约2至约4mg/g的还原酶。

12.如权利要求11所述的细胞提取物，其特征在于，所述细胞浆液包含约4至约6mg/g的还原酶。

13.如权利要求11所述的细胞提取物，其特征在于，所述重组还原酶是核糖核苷酸还原酶。

14.一种测定所选氨基酸残基在还原酶中的功能的方法，该方法包括：

使所选氨基酸残基突变成3-氨基酪氨酸(NH₂Y)从而产生在对应于所选氨基酸的位置包含NH₂Y的重组突变型还原酶；

将该重组还原酶与该还原酶的一种或多种底物或效应物混合；和

检测NH₂Y·的形成。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述还原酶是核糖核苷酸还原酶。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所选氨基酸残基是Y残基。

17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述底物包括CDP、ADP、GDP或UDP，所述效应物包括ATP。

18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，包括在所述混合之前先还原该还原酶。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，还原所述重组还原酶包括从表达所述重组还原酶的细胞或细胞培养物中纯化所述重组还原酶，以及将所得纯化的还原酶与还原剂一起培育。

20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，检测NH₂Y的形成包括测定该还原酶中NH₂Y残基的EPR谱。

21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，检测NH₂Y的形成包括在所述混合之后进行停流光谱学方法以测定NH₂Y·形成的动力学。

22.如权利要求14所述的方法，其特征在于，检测NH₂Y的形成包括在所述混合之后进行快速冷冻猝灭EPR以测定NH₂Y·形成的动力学。