[发明专利]斑马鱼Caspy2基因在制备治疗肿瘤的药物中的用途

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤免疫基因治疗领域，具体涉及斑马鱼的Caspy2基因在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

斑马鱼(Danio rerio，俗称zebrafish)具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多特点，为生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一。但目前对斑马鱼自身基因对高等脊椎动物尤其是人的影响研究非常的少。Caspy2基因是一个来自斑马鱼的caspase基因家族成员，有文献报导它是一个斑马鱼细胞凋亡诱导基因，在斑马鱼的发育过程中扮演重要的作用，而Caspy2基因是否对人的肿瘤有无治疗效应目前并没有文献报导。

诱导肿瘤细胞凋亡或激发产生抗肿瘤免疫反应是目前抗肿瘤治疗的两种重要技术手段，目前大多数治疗方案都是采用单一的抗肿瘤效应进行，如果能够将诱导肿瘤细胞凋亡和激发产生抗肿瘤免疫反应结合起来将能获得更好及更持久的抗肿瘤疗效，但目前未见相关报导。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种斑马鱼Caspy2基因及其编码的蛋白质的新用途。具体地说，该用途为斑马鱼Caspy2基因或其编码的蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。

其中，上述斑马鱼Caspy2基因的序列为SEQ ID NO.3所示或为SEQ ID NO.3所示序列的保守性变异体。

其中，上述斑马鱼Caspy2基因所编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示或为SEQID NO.4所示氨基酸序列的保守性变异体。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供了一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物是由斑马鱼Caspy2基因编码的蛋白或能表达斑马鱼Caspy2基因的表达载体或宿主细胞添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。其中的斑马鱼Caspy2基因编码的蛋白或能表达斑马鱼Caspy2基因的表达载体或宿主细胞是作为主要的活性成分。

其中，上述斑马鱼Caspy2基因的序列为SEQ ID NO.3所示或为SEQ ID NO.3所示序列的保守性变异体。

其中，上述斑马鱼Caspy2基因编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示或为SEQ IDNO.4所示氨基酸序列的保守性变异体。

进一步的，上述能表达斑马鱼Caspy2基因的表达载体为pcDNA3.1-Caspy2。

其中上述表达载体pcDNA3.1-Caspy2是由以下步骤制备得到：

a、利用上、下游引物对斑马鱼总RNA进行RT-PCR反应，扩增得到1215bp的Caspy2基因编码区cDNA片段；

b、将步骤a得到的编码区cDNA片段和pcDNA3.1(+)分别用限制性核酸内切酶BamH I、EcoRV进行双酶切，将酶切产物进行连接并转化大肠杆菌DH5a，通过菌落筛选、酶切鉴定、DNA测序鉴定，得到Caspy2基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-Caspy2。

本发明创造性地发现利用表达载体表达Caspy2基因编码的蛋白质能够诱导肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤免疫的双重抗肿瘤效应。对CT26细胞、LLC细胞、A549细胞中，结果对这3种肿瘤细胞的增殖产生了显著的抑制效应；利用阳离子脂质体包裹Caspy2基因对CT26和MethA荷瘤小鼠进行治疗，产生了很强的抗肿瘤作用，发现产生非常好的抗肿瘤作用的原因是经过异种的Caspy2基因治疗后产生了诱导肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤免疫的双重抗肿瘤效应，而且这种抗肿瘤免疫效应是特异的、长期的，优于现有的普通肿瘤治疗方案。

因此本发明Caspy2基因及其编码蛋白的新用途为肿瘤的免疫基因治疗提供新的选择。本发明抗肿瘤药物抗肿瘤疗效好，并具有特异的、长期的免疫效应，是一种很有开发价值的抗肿瘤药物。

附图说明

图1、质粒pcDNA3.1(+)的结构示意图；

图2、MTT实验检测各处理组肿瘤细胞的增值活性；

图3、流式细胞术检测各处理组细胞的凋亡情况；

图4、肿瘤生长曲线和小鼠的生存期；

图5、肿瘤组织的HE染色；

图6、肿瘤组织的细胞凋亡染色结果

图7、肿瘤组织的细胞凋亡指数；

图8、pcDNA3.1-Caspy2治疗后所产生的长期抗肿瘤免疫反应。

具体实施方式

以下结合附图通过对具体实施方式的描述以详细说明但不限制本发明。

实施例一Caspy2基因的获取和重组质粒DNA的构建