[发明专利]一种重组表达载体的基因序列及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说是一种重组表达载体的基因序列及其构建方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性菌，具有强致病性，是继发感染和败血症、胃肠道感染、爆发性食物中毒等人兽共患疾病的主要致病菌。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。

研究已经发现金黄色葡萄球菌主要通过其表面的弹性纤维结合蛋白(EbpS)与宿主的细胞外基质结合，从而引起宿主的感染。

现有技术条件下，利用PCR技术扩增该弹性纤维结合蛋白(EbpS)的表达基因时，普遍采用普通的Taq酶，进而进行PCR得到的基因序列与基因库中的基因序列测序比对的结果说明其扩增出的目的基因产生了突变的序列，该过程的突变率往往比较高，如此导致目的基因的获得比较困难，无形的增加了实验和材料的经济投入。怎样设计和进一步完善实验以高效的得到稳定的目的基因以及其重组表达载体，是现阶段生物工程技术领域或免疫医学领域科技发展有待解决的重要课题之一。

发明内容

本发明的技术任务是针对金黄色葡萄球菌的致病主要因素，提供一种含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因的重组表达载体及其构建方法，可通过免疫学技术来实现获得对金黄色葡萄球菌的抗体制剂。

本发明的技术方案是按以下方式实现的，一种重组表达载体，该重组表达载体的基因序列中含有能够表达金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白的目的基因序列。

该重组表达载体的基因序列具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列。

一种含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因的重组表达载体的构建方法，其步骤包括：

(1)根据Genbank中ATCC25923标准菌株nEbpS基因序列，合成在5’端引入BamH I酶切位点的具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列的上游引物；合成在5’端引入HindIII酶切位点的具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列的下游引物；

(2)采用高保真酶、上游引物和下游引物利用PCR方法从金黄色葡萄球菌ATCC25923标准菌株基因组中扩增出nEbpS蛋白目的基因；

(3)PCR产物的回收和纯化；

(4)PCR产物的双酶切处理和纯化；

(5)克隆载体的双酶切处理及纯化；

(6)目的片段与克隆载体的连接；

(7)连接产物诱导转化宿主细胞感受态；

(8)培养转化后的宿主细胞，筛选、鉴定、扩培，抽提得重组质粒；

(9)重组质粒双酶切处理和纯化；

(10)表达载体双酶切处理和纯化；

(11)目的片段与表达载体的连接，得重组表达载体。

所述的克隆载体采用pMD19-T。

所述的宿主感细胞选用DH5α大肠杆菌。

所述的筛选是对转化宿主细胞进行氨苄青霉素抗性菌株的筛选。

所述的表达载体采用pQE30。

该含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因的重组表达载体的用途，是将该重组表达载体转化到大肠杆菌M15中，在IPTG的诱导下获得EbpS蛋白，利用亲和层析将EbpS蛋白进行纯化后制备乳化抗原，将乳化抗原免疫宿主，收集宿主血清，制备EbpS抗体制剂。

本发明的含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因的重组表达载体及其构建方法与现有技术相比所产生的有益效果是：

(1)本发明采用高保真酶Pyrobest DNA Polymerase替代通常技术的Taq酶。Taq酶在PCR扩增得到的基因序列经常有序列的突变，并且由于碱基A的插入而引起插入突变，影响实验效果。采用高保真酶所得基因序列没有任何突变，高保真酶扩增得到的片段全部为平滑末端，所以在后续的连接中并未采取A-T连接，而是利用双酶切后通过连接酶连接。采用了高保真酶，得到了高度准确的平末端基因片段。这一步保证了克隆基因片段的精确性。

(2)本发明采用pQE30作为表达载体，其自身带有6×His标签，含有β-内酰胺酶基因，因此具有氨苄霉素抗性，还具有优化的启动子-操纵元模式，以T5启动子起始转录-翻译系统；本身带有启动子和终止子，可以高效翻译外源基因。