[发明专利]利用酶活性的竞争性干扰和恢复检测被分析物

说明书

技术领域

本发明的内容涉及利用多核苷酸和结合分子来检测溶液中的被分析 物的方法，其中该方法利用了酶活性的竞争性干扰和恢复。

背景技术

样品中被分析物的定量和定性检测经常用于化学和医学领域。例如， 免疫分析方法是用于检测被分析物的典型结合分析方法，被分析物可以包 括，例如病毒和细菌抗原、免疫球蛋白、激素、细胞、药物、毒素和管制 药物。由于这些技术通常缺乏足够的灵敏度和精密度，因此已经开发出放 大系统。

已经开发出许多不同的用于定性和定量检测样品中的被分析物的免 疫分析方法，如酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和酶 免疫分析(EIA)。例如，免疫分析可以设定为均相或异相分析，其中异相 分析为包含固相和液相的两相分析，而均相分析是以单一相进行的。异相 分析，如ELISA是常用的，但不利的是其要求的步骤比均相分析多。而且， 除了需要额外的清洗步骤外，异相分析的缺点还在于其永远不能真正地实 现自动化。现有的均相分析，例如酶片段互补(EFC)。EFC是基于抗体- 抗原结合的均相分析，但不利的是其灵敏度和分辨率低，因为其通常只对 小抗原起作用，并且仅在具有高背景活性的分析中起作用。

问题在于当前可用的分析方法都需要有技术的技术人员，只有几种技 术成功地适用于选择的被分析物的检测，并且没有既是均相的又在各种分 析条件下对各种被分析物都灵敏的方法。因此，技术人员希望得到一种易 于使用的均相分析方法，其耗时少于异相分析，具有高灵敏度和精密度而 且能实现自动化。

发明内容

本发明提供的教导主要涉及利用多核苷酸和结合分子检测溶液中的 被分析物的方法，其中该方法利用了酶活性的竞争性干扰和恢复。该教导 还涉及用于实施该方法的试剂和试剂盒。

在某些实施方案中，本发明的教导涉及了测定溶液中被分析物的浓度 的方法。该方法包括选择结合化合物；选择被分析物的类似物并使类似物 结合到多核苷酸底物以构成试剂，用于利用期望的多核苷酸反应测定分析 溶液中被分析物的含量。分析溶液中试剂与结合化合物的结合与分析溶液 中被分析物与结合化合物的结合相竞争。该方法还包括选择用于催化期望 的多核苷酸反应的期望的酶。

选择并构成成分后，可以选择该方法中使用的成分的相对用量。同样 地，该方法还包括针对分析溶液中被分析物的给定浓度和预先选定的期望 的酶的量，确定结合化合物与试剂的期望比率。

然后形成分析溶液，其包含一定量的结合化合物和含量待测的被分析 物。随后，将一定量的试剂加到分析溶液中，其中试剂的用量和结合化合 物的用量实现了结合化合物与试剂的期望比率。再向分析溶液中加入预先 选定用量的期望的酶，用于催化期望的多核苷酸反应。然后测定期望的多 核苷酸反应中期望的酶活性，来确定分析溶液中被分析物的含量。测定酶 活性的方法的例子包括但不限于技术人员所知的荧光和吸光率测定方法。

在某些实施方案中，结合化合物包括配体结合分子、抗体或细胞受体。 在某些实施方案中，类似物包含被分析物的结构或者为具有被分析物的分 子结构的化合物。在某些实施方案中，多核苷酸底物包括多核苷酸引物、 多核苷酸模板或二者的组合。在某些实施方案中，多核苷酸底物为双链 DNA或单链DNA。

在某些实施方案中，期望的多核苷酸反应包括核苷酸聚合反应、核苷 酸裂解反应或者核苷酸聚合反应和核苷酸裂解反应的组合。在某些实施方 案中，期望的多核苷酸反应包括核苷酸重组反应。

在某些实施方案中，本发明的教导涉及用于竞争性结合分析的试剂。 该试剂可以包括结合到类似物的多核苷酸底物，并且可以选择类似物(i) 与分析溶液中预先选定的结合化合物相结合；以及(ii)与分析溶液中被 分析物与预先选定的结合化合物的结合相竞争。可以选择多核苷酸底物参 与期望的多核苷酸反应，该反应通过分析溶液中结合化合物与类似物的结 合而抑制或终止。

在某些实施方案中，本发明的教导涉及用于测定分析溶液中被分析物 含量的竞争性结合分析试剂盒。该试剂盒包含上述试剂，以及用于竞争性 结合分析的结合化合物，其中分析溶液中试剂与结合化合物的结合，与分 析溶液中被分析物与结合化合物的结合相竞争。试剂盒还包括用于催化期 望的多核苷酸反应的酶，其中测定酶的活性用于确定分析溶液中被分析物 的含量。

附图说明