[发明专利]一种应用悬浮芯片技术检测宋内志贺氏菌方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分子生物学检测芯片，具体的是一种应用悬浮芯片技术对宋内志贺氏菌进行检测。

背景技术

悬浮芯片技术是将基因芯片技术与流式细胞仪技术结合产生的一种新技术，是一种多重数据获取和分析平台，全名为“多功能多指标同步分析体系”(Flexible Multiple Analyte Profiling，xMap)，也称为Multi-Analyte SuspensionArray，有机整合了荧光编码微球、激光技术、微流体技术、快速信号处理和数据分析系统，即保证了信号质量，又提供高通量的新一代分子检测技术平台。悬浮芯片与传统的基因芯片最大不同之处在于，传统的基因芯片点样在玻片或尼龙膜上，依靠坐标定位进行寻址，而悬浮芯片将检测探针共价交联到不同的色标微球上，根据色标微球上所带的荧光素进行区分。

悬浮芯片系统主要由三部分组成：1、微球直径5.6μm左右，由聚苯乙烯构成的，表面带有约10⁸个羧基位点，可与寡核苷酸探针和蛋白以肽键耦联；2、荧光素微球中标记了红色和橙色荧光素，每种分成10个浓度梯度，将微球分成可被识别的100种微球，当微球被635nm激光激发后，能发射658nm和712nm的荧光；3、检测仪因微球直径5.6μm，并被荧光标记，采用流式细胞仪技术原理进行检测。

原理：每一种色标微球可通过羧基，与特定的分析物质(寡核苷酸探针、抗原、抗体等)共价结合。将标记生物探针的微球与待测物进行特异性的结合，再和带有第三种荧光素的报告分子反应，在一个反应孔内可同时对一个样本中的100种不同目的分子进行检测。反应后，采用96孔板进行进样。检测仪自动将反应液吸起加入蠕动泵，泵入一个微细管中，在鞘液的作用下，单排分布的微球单个通过检测通道。检测通道中设有两个激光探头，一个探头可发射635nm波长的激光，可激发标记微球的两种荧光素，从而识别不同的色标微球，进行定性检测；另一激光探头可激发报告分子的荧光素，通过测定微球所带报告分子荧光信号的强度，可进行定量检测。因此，悬浮芯片可进行定性定量检测目标分子。当样本中含有目的分子，目的分子与特定的微球所带的探针吸附在一起时，两道激光所激发的荧光均可被检测到；若样本中不含目的分子，则仅能检测到微球所带的荧光。通过数字信号处理器与计算机自动统计软件，分析两道激光所激发荧光的波长和信号强度，从而判断待检样本中几种至数十种检测目标物，并通过检测荧光信号强度，对检测物进行定量分析。自动加样器依次将不同样本加入蠕动泵中，样本之间用一小段气柱分隔开，这样在连续分析过程中不但可以区分不同样本，可还以防止样本间的污染。

与其它蛋白质和核酸检测方法相比较，悬浮芯片具独特优点：

1)应用范围广微球表面的羧基可与核酸探针和蛋白分子耦联，能对目的核酸和蛋白分子进行定性定量研究；

2)敏感性高以微球作为反应载体，增加了反应物接触面积；每个微球表面带有约10⁸个羧基位点，以共价键方式耦联寡核苷酸探针、抗体或抗原，探针密度高，产生的信号强；使用荧光检测，放大了反应信号，敏感性大大提高。

3)重复性好所进行的生物反应是在液相环境中进行的，利于保持核酸、蛋白等生物分子天然构象，克服了传统芯片空间效应的影响，也更利于探针和被检物质的反应，提高了检测的准确性；

4)信噪比低在微细管中对单个微球进行检测，不存在本底影响检测的问题，无需洗脱去除本底；

5)高通量可以同时对同一样本中的多重不同目的分子进行定性定量分析，即提高了检测信息通量，又节约了样本用量；

6)快速高效大大提高了反应速度和检测速度。由于所进行的生物反应是在液相环境中进行的，杂交仅需15分钟即可完成，提高了反应速度；在35—60分钟内，可对96个不同样本分别同时进行多达100种指标的检测；利用96孔板和自动进样系统，可连续进行n×96个样品的检测。

7)成本低制备过程无需特殊设备，只进行羧基与氨基间的脱水成肽反应即可，简单易行；由于是液体储存方式，一次制备可多次使用，平均每个指标检测成本仅需2.5—5.0元；

8)易于标准化基于上述特点，使得该技术能够做到标准化，易于试剂盒的研制和推广。目前，悬浮芯片是美国FDA唯一批准用于临床诊断(自身免疫病检测和人类白细胞抗原分型)的生物芯片。