[发明专利]一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法。

背景技术

胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)又称硅酸盐细菌，该菌普遍具有解钾、固氮、解磷功能。我国从50年代开始对该菌进行大量应用研究，90年代开发成微生物钾肥在全国大面积推广应用。目前，胶质芽孢杆菌作为重要的微生物钾肥生产菌，广泛用于农业生产，有效促进了绿色农业的发展。近几年，胶质芽孢杆菌在冶金、陶瓷、废水处理等热点领域的应用研究也倍受关注，如用于矿石脱硅，有效提高矿石品质；作为添加剂，改善陶瓷性能；作为絮凝剂用于净化废水、去除或富集重金属等。胶质芽孢杆菌制剂因安全、环保、易实现工业化生产等优点，极具应用潜力。

目前关于胶质芽孢杆菌的菌剂已又很多种，目前多用传统的分离培养方法对该菌进行检测和鉴定。分离培养方法主要依据胶质芽孢杆菌的菌落特征，即透明、凸起、玻璃样和粘度等，据研究具有相似形态特征的菌种还又其它种如土壤芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌等，因此传统检测方法明显存在检测结果不可靠、历时时间长、过程繁琐等缺点。可见，建立一种快速简便的胶质芽孢杆菌检测方法对相关产品的检测及研究该菌在土壤中的生态学行为将具有重要意义。gyrB是编码促旋酶B亚单位的基因，由于该基因是单拷贝且具有一定的保守性和变异度，近年越来越广泛应用于菌种鉴定。本发明在测定胶质芽孢杆菌多个菌株的gyrB基因的基础上，设计特异性引物，建立了胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法。

一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法包括如下步骤：

1)配制菌体前处理缓冲液，其配方为：10mmol/l Tris·Cl，1mmol/l EDTA，pH8.0；

2)样品预处理获得菌体；

3)将菌体用菌体前处理缓冲液洗涤和悬浮，菌体悬液在沸水中温浴3-10min后，经4℃、12000-15000rpm离心10-15min，上清即为DNA样品，冰浴保存；

4)以DNA样品为模板，特异性PCR扩增gyrB基因片段；

5)PCR扩增产物检测与分析。

所述的样品预处理获得菌体步骤：对于芽孢形态的微生物样品，将芽孢悬浮于胶质芽孢杆菌的专用培养液中，28-30℃温浴10-20min使芽孢萌发成菌体，5000-10000rpm离心3-5min收集菌体；

所述的样品预处理获得菌体步骤：对于微生物菌落样品，直接挑取菌落；对于液体菌体样品，5000-10000rpm离心3-5min收集菌体。

所述的以DNA样品为模板，特异性PCR扩增gyrB基因片段步骤：

1)特异性PCR扩增反应体系为20μl，包括：10×缓冲液2μl，0.3mmol.l^-1的dNTP2μl，浓度为0.1μmol.l^-1的上游引物1μl，浓度为0.1μmol.l^-1的下游引物1μl，DNA样品1-2μl，Taq酶0.3-0.5U，去离子水11.7-12.7μl；

2)特异性PCR扩增程序为：94-95℃预变性4-5min，94-95℃变性30-60s，59-63℃复性30-60s，72℃延伸45-60s，循环30-35次后，72℃延伸8-10min。

所述的上游引物为F2：5’-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT-3’；下游引物为R5：5’-ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG-3’。

所述的PCR扩增产物检测与分析步骤：

1)取5-10μl的PCR扩增产物，在1.0-1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色10-15min后，清水漂洗10-15min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增产物；

2)根据PCR扩增产物的有无及其所对应的稀释倍数，计算确定样品中的胶质芽孢杆菌浓度。

另一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法包括如下步骤：

1)采用溶菌酶-SDS-高盐法提取土壤样品中的DNA；

2)以DNA为模板，降落式PCR扩增gyrB基因片段；

3)PCR产物检测与分析步骤为：取5-10μl的PCR产物，在1.0-1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色10-15min后，清水漂洗10-15min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增产物，根据PCR扩增产物的有无确定样品中是否有胶质芽孢杆菌。

所述的以DNA样品为模板，降落式PCR扩增gyrB基因片段步骤：