[发明专利]一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法

权利要求书

1.一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：

1)配制菌体前处理缓冲液，其配方为：10mmol/l Tris·Cl，1mmol/l EDTA，pH 8.0；

2)样品预处理获得菌体；

3)将菌体用菌体前处理缓冲液洗涤和悬浮，菌体悬液在沸水中温浴3-10min后，经4℃、12000-15000rpm离心10-15min，上清即为DNA样品，冰浴保存；

4)以DNA样品为模板，特异性PCR扩增gyrB基因片段；

5)PCR扩增产物检测与分析；

所述的以DNA样品为模板，特异性PCR扩增gyrB基因片段步骤：

1)特异性PCR扩增反应体系为20μl，包括：10×缓冲液2μl，0.3mmol·l^-1的dNTP 2μl，浓度为0.1μmol·l^-1的上游引物1μl，浓度为0.1μmol·l^-1的下游引物1μl，DNA样品1-2μl，Taq酶0.3-0.5U，去离子水11.7-12.7μl；

2)特异性PCR扩增程序为：94-95℃预变性4-5min，94-95℃变性30-60s，59-63℃复性30-60s，72℃延伸45-60s，循环30-35次后，72℃延伸8-10min；

所述的上游引物为F2：5’-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT-3’；下游引物为R5：5’-ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG-3’。

2.根据权利要求1所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征在于所述的样品预处理获得菌体步骤：对于芽孢形态的微生物样品，将芽孢悬浮于胶质芽孢杆菌的专用培养液中，28-30℃温浴10-20min使芽孢萌发成菌体，5000-10000rpm离心3-5min收集菌体。

3.根据权利要求1所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征在于所述的样品预处理获得菌体步骤：对于微生物菌落样品，直接挑取菌落；对于液体菌体样品，5000-10000rpm离心3-5min收集菌体。

4.根据权利要求1所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征在于所述的PCR扩增产物检测与分析步骤：

1)取5-10μl的PCR扩增产物，在1.0-1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色10-15min后，清水漂洗10-15min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增产物；

2)根据PCR扩增产物的有无及其所对应的稀释倍数，计算确定样品中胶质芽孢杆菌的相对浓度。

5.一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：

1)采用溶菌酶-SDS-高盐法提取土壤样品中的DNA； 

2)以DNA样品为模板，降落式PCR扩增gyrB基因片段；

3)PCR产物检测与分析步骤为：取5-10μl的PCR产物，在1.0-1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色10-15min后，清水漂洗10-15min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增产物，根据PCR扩增产物的有无确定样品中是否有胶质芽孢杆菌；

所述的以DNA样品为模板，降落式PCR扩增gyrB基因片段步骤：

1)PCR反应体系为20μl，包括：10×缓冲液2μl，0.3mmol·l^-1的dNTP 2μl，浓度为0.1μmol·l^-1的上游引物1μl，浓度为0.1μmol·l^-1的下游引物1μl，DNA样品1-2μl，Taq酶0.3-0.5U，去离子水11.7-12.7μl；

2)降落式PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、69℃退火30s，每次下降1℃，直到60℃，每个温度循环2次，72℃延伸30s；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，循环18次；72℃延伸8min；

所述的上游引物为F2：5’-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT-3’；下游引物为R5：5’-ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG-3’。