[发明专利]含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺以及纯化Kringle 5蛋白的工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物、医药研制技术，采用基因重组技术在大肠杆菌中表达血管生成抑制剂Kringle 5，通过正交试验对工程菌的发酵工艺进行了优化，并采用亲合层析、阳离子交换层析两步法纯化目的蛋白。

背景技术

Folkman等于1972年首次提出：肿瘤的生长依赖于血管的生成，虽然小的瘤体可以通过渗透作用从周围组织中获得营养，但它的进一步生长则依赖于形成新的血管以获得充分的营养。血管生成不仅为肿瘤生长提供了必须的营养，同时也为其扩散转移提供了重要的途径，许多实验已经证明了肿瘤的生长和迁移依赖于血管的生成。通过抑制血管生成来抑制肿瘤的生长现在已经成为一种新的治疗肿瘤的思路和方法。

1994年，O’Reilly等发现内源性血管生成抑制剂Angiostatin是由纤溶酶原前四个饼环区组成。1997年，Cao等发现纤溶酶原N端的第五个饼环区(plasminogen kringle 5)同样具有抑制血管内皮细胞增殖和肿瘤生长的能力，而且抑制能力比Angiostatin更强。Kringle 1-3虽然具有抑制内皮细胞增殖的活性，但对内皮细胞移行的抑制作用不大；Kringle 4虽然在阻止内皮细胞移行方面起着重要作用，但几乎不表现出抑制内皮细胞增殖的活性；而Kringle 5特异抑制内皮细胞增殖的活性最高，是迄今为止动物实验中抗肿瘤血管生成最有效的药物之一。

近年来，国内外先后报道了有关肿瘤血管生长抑制剂Kringle 5基因的克隆和表达，以及Kringle 1-4和Kringle 1-3基因大肠杆菌的发酵工艺研究^[13]，但未见有关含Kringle 5基因的工程菌发酵条件优化和有关Kringle 5蛋白纯化的系统地、全面的实验报道，阻碍了Kringle 5蛋白的大规模生产和临床试验。目前在基因工程菌发酵条件的优化方面，有关培养基优化的研究很少，且主要通过单因素实验对发酵条件进行优化研究，实验方案和结果仍需进一步完善。

发明内容

本发明提供了一种含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺以及纯化Kringle5蛋白的工艺。大大提高了Kringle 5蛋白的表达量。本发明生产工艺简单，回收率高，并可线性放大到工业规模化生产。

本发明的技术解决方案为：

含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺是，其特征在于：

设计了15种不同的发酵培养基，在摇瓶培养方式下，通过测定工程菌在15种培养基中的比生长速率和目的蛋白kringle5的表达量，确定了适宜于工程菌生长和目的蛋白表达的培养基；采用优化后的培养基，通过正交试验，确定了最佳的发酵工艺；按照摇瓶培养优化后的条件，在micro DCU-400型20L自控罐中进行分批培养，确定了最佳的溶氧范围大约为40％。

纯化Kringle 5蛋白的两步工艺，其特征在于：

(1)根据Kringle5 DNA序列，设计了从重组质粒pThioA/K5中钓Kringle5的上下游引物，并在其中分别加入了Nco I和EcoR I酶切位点，在一定条件下，通过PCR反应进行Kringle 5片段的扩增，扩增产物用1％-2％的琼脂糖电泳检测后，在一定条件下酶切，再将酶切产物全部进行1％-2％的琼脂糖凝胶电泳，将载体双酶切片段和Kringle5双酶切片段酶连，所获得的重组质粒pET32a/K5按常规方法转入BL21(DE3)后进行培养，重组质粒和重组菌提质粒后均用Nco I和EcoR I双酶切鉴定后进行序列分析；

(2)设计了15种不同的发酵培养基，在摇瓶培养方式下，通过测定工程菌在15种培养基中的比生长速率和目的蛋白kringle5的表达量，确定了适宜于工程菌生长和目的蛋白表达的培养基，采用优化后的培养基，通过正交试验，确定了最佳的发酵工艺，温度大约35℃，pH值6.5-7.0，摇床转速200r/min-260r/min，接种量8％-10％，诱导剂量0.6mmol/L-1.0mmol/L，诱导时机为工程菌生长的中后期，诱导时间6h-8h。按照摇瓶培养优化后的条件，在microDCU-400型20L自控罐中进行分批培养，确定了最佳的溶氧范围大约为40％，菌体浓度通过分光光度计测定OD₆₀₀而获得，Kringle 5蛋白表达水平的测定用SDS-PAGE电泳法，总蛋白的测定用Bradford方法，葡萄糖浓度的测定用3，5-二硝基水杨酸法；