[发明专利]一种利用限制性内切酶双酶切检测SNP的方法

权利要求书

1.一种联合限制性酶切法和质谱法以检测单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

(1)确定SNP位置：针对待检核酸序列可能存在的SNP，确定SNP在待检序列中的位置；

(2)设计正向引物：根据SNP的位置，设计正向引物，其中正向引物3’端位于SNP位点5’端上游1-47bp处，正向引物5’端含有一种特殊限制性内切酶的识别位点，而在待检核酸序列中，所述的特殊限制性内切酶的酶切位点位于识别位点3’端下游1-25bp处，并位于SNP的5’端上游1-25bp的范围内，其中，所述的位置范围取决于具体的限制性内切酶；

(3)设计反向引物：根据SNP的位置，设计反向引物，其中反向引物位于另一条核酸互补链上的SNP位点5’端上游1-47bp处，反向引物5’端含有另一种特殊限制性内切酶的识别位点，而在待检核酸序列中，所述的特殊限制性内切酶的酶切位点位于识别位点3’端下游1-25bp处，并位于SNP的5’上游端1-4bp的范围内，其中，所述的位置范围取决于具体的限制性内切酶；

(4)PCR扩增：通过PCR扩增，获得包含两个特殊限制性内切酶的识别位点、两个酶切位点、SNP位点的双链扩增产物，其中SNP位点位于正向引物限制性内切酶酶切位点和反向引物限制性内切酶酶切位点之间；

(5)限制性内切反应：使用所述的两种特殊限制性内切酶分别进行两次限制性内切反应，获得两条包含SNP位点的单链短片段；

(6)质谱检测：将包含SNP的单链短片段进行质谱检测，通过与野生型单链短片段的分子量进行比较，确定SNP的基因型。

2.权利要求1所述的方法，其中在步骤(5)中，可以同时进行两次限制性内切反应。

3.权利要求1所述的方法，其中如果所述的两种特殊限制性内切酶是同一种特殊限制性内切酶，则只需进行一次限制性内切反应。

4.权利要求2或3所述的方法，其中所述的特殊限制性内切酶包括BsmI、BsrI、EarI、SapI、BspQI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsrDI、BstF5I、BtsI、BtsCI、BbsI、AlwI、BccI、PleI、FauI、BfuAI、BspMI、AatII、BmrI、MlyI、SfaNI、HgaI、BciVI、HpyAV、MnlI、HphI、MboII、BbvI、BspCNI、FokI、BseRI、BsmFI、BtgZI、EciI、BceAI、BpmI、BpuEI、BsgI、AcuI、MmeI、NmeAIII、EcoP15I。

5.权利要求1-4所述的方法，其中在进行质谱检测之前，还包括对酶切产物进行纯化处理，以减少对最终检测结果的干扰，提高分辨率。

6.权利要求5所述的方法，其中纯化方法包括树脂纯化。

7.权利要求1-6所述的方法，其中所述的质谱检测包括：将基质与纯化后的酶切产物点到质谱仪所用的检测靶上，供下一步的质谱检测，基质的具体配方和与用量视样品浓度、样品用量、环境条件、机器状态而定。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的质谱检测是利用高分辨率的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测酶切片段的分子量，由于单个SNP的分子量变化在9个或9个Da以上，而高分辨率的质谱仪能很好的区分单个碱基的差异，因此通过与野生型短片段分子量的比较，可确定所检测SNP在特定个体中的基因型。