[发明专利]一种新型蛋白质分子定向进化方法

说明书

技术领域：

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种根据蛋白质分子的空间三维结构或者如序列信息和二级结构信息等等所有有用的信息，分析其分子特性，理性选择目的突变位点，并进行随机重复递推式基因序列突变，之后通过筛选，获得具有目的特性的新型蛋白质分子的定向进化方法。

背景技术：

荷兰科学家格里特于1838年首次发现蛋白质，蛋白质是生物体内一种极为重要的高分子有机物，凡是有生命的物质离开蛋白质就无法生存。蛋白质的基本组成单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白质是由一条或多条多肽链组成的，每一条多肽链有十几个至数百个不等的氨基酸残基，各种氨基酸残基按一定的顺序排列。蛋白质是生命的体现者，现代生物工程技术的发展，使得人类可以获得离体的、纯化的、并具有生物活性的蛋白质，可用于生物医药和生物催化等等领域。可是，生物体内天然存在的蛋白质，其特性往往不尽人意，将其提取出来，并在体外使用时常常具有很多缺点，比如活性低，对高温、低温、高pH、低pH、高压、辐射等等极端环境的耐受性差。因此需要对其进行人工的分子改造，使合成的蛋白质更符合人类的需要。由于每一种蛋白质都有自己独特的氨基酸排列顺序(一级结构)，所以只要改变其中关键的氨基酸序列就能改变蛋白质的性质。而氨基酸又是由核酸序列上的三联体密码子决定的，因此只要改变构成遗传密码的碱基序列就能达到改造蛋白质的目的。这一技术始于20世纪90年代，称为定向进化技术(Directedevolution)，其中运用最为广泛的实际操作方法为错误倾向PCR(Error-prone PCR)和DNA改组(DNA shuffling)。其核心思想是随机地改变编码蛋白质的基因序列，获得文库，然后通过大量的筛选，从文库中获得正向进化的目的基因。但是此类方法的随机性很大，其成败与否和效果优劣在于筛选量的大小和准确性。数十年前，人类已知蛋白质分子的理化特性和生物学活性直接取决于其空间三维结构，而根据蛋白质分子的空间三维结构，可以分析出蛋白质的生物活性和某一理化特性具体和哪些氨基酸残基相关联。随着现代结构生物学技术的发展，使用X射线衍射法和NMR法等方法，人类已经获得了很多蛋白质分子的空间三维结构，但是由于自然界存在的蛋白质分子种类众多，而通过实验方法解析蛋白质分子的空间三维结构费用高，步骤繁杂，难度较大，因此，通过实验方法得到空间结构的蛋白质分子的数量所占比例比较少。而近几年，通过使用生物信息学的方法，借助计算机技术，人工模拟蛋白质分子空间三维结构取得了很大的进展。基于人工模拟的空间三维结构或者实验方法解析出的空间三维结构，分析出蛋白质分子中可能与某一特性相联系的氨基酸残基的位置，并理性选择这些位置，对基因进行突变，可以提高正向进化的效率，减小筛选压力。

发明内容：

本发明的目的是通过使用X射线衍射法、NMR法等等实验方法解析蛋白质分子的空间结构。或者使用计算机技术，根据蛋白质分子的序列信息，模拟其空间三维结构。进而根据得到的三维结构信息或者其它信息，分析其分子特性，理性选择目的突变位点，并进行随机重复递推式基因序列突变，之后通过筛选，获得具有目的特性的新型蛋白质分子。本发明的定向进化技术结合了理性过程和随机过程的优势，其具体步骤如下：

1.获得蛋白质分子的核酸序列和氨基酸序列

通过使用基因工程学原理，用PCR法或者文库法等等方法，得到目的蛋白质分子的基因片段，然后再使用“酶切”、“连接”、“转化”等等实验技术，将目的基因片段连上载体，导入宿主菌并保存。之后对基因进行测序，获得基因的碱基序列，根据三联密码子，可以由基因序列转换得到氨基酸序列。或者通过搜索Genbank、EMBL、DDBJ等等国际序列数据库，获得目的蛋白质分子的核酸序列和氨基酸序列，使用全基因合成法，合成目的基因(如果该序列信息受到专利保护，应事先获得专利所有者的授权)。

2.获得三维结构信息

目的蛋白质分子的三维结构信息可以通过实验法和计算机辅助模拟法得到。

实验法包括X射线晶体衍射法和NMR法。X射线衍射分析主要是根据衍射线的方向和强度，即衍射图案上斑点的位置和黑度，通过电子计算机，绘制出电子密度图，从中构建出三维分子图像。NMR分析的原理是：处于一个静磁场中的核子会由于磁场的作用而处于不同的能量状态，当一个外界的摆动的磁场来扰动处于“平衡”状态的核子时，吸收了能量的核子就会在不同的能级之间跃迁，并在此过程中释放出能量。而放出的能量被检测到之后，经过分析和计算就可以得到蛋白质分子内部的结构信息。