[发明专利]一种新型蛋白质分子定向进化方法

权利要求书

1.一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其主要流程是：通过使用X射线衍射法、NMR法等等实验方法解析作为进化起点的蛋白质分子的空间结构。或者使用计算机技术，根据蛋白质分子的序列信息，模拟其空间三维结构。进而根据得到的三维结构信息，或者根据该蛋白质分子的其它信息(如序列信息、二级结构信息等等所有有用的信息)，分析其分子特性，理性选择目的突变位点，并进行随机重复递推式基因序列突变，之后通过筛选，获得具有目的特性的新型蛋白质分子。其主要特征是：结合了理性过程和随机过程的优势。

2.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是在获取蛋白质分子的空间三维结构时，既可以使用X射线衍射法、NMR法等等实验方法，也可以使用计算机模拟方法。

3.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是在获取蛋白质分子的基因和序列信息时，既可以使用基因工程学原理，用PCR法或者文库法等等方法，得到目的蛋白质分子的基因片段，然后再使用“酶切”、“连接”、“转化”等等实验技术，将目的基因片段连上载体，导入宿主菌并保存。之后对基因进行测序，获得基因的碱基序列，根据三联密码子，由基因序列转换得到氨基酸序列；也可以通过搜索Genbank、EMBL、DDBJ等等国际序列数据库，获得目的蛋白质分子的核酸序列和氨基酸序列，使用全基因合成法，合成目的基因。

4.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是其中的“突变位点”定义为：既可以是蛋白质分子上的一个单氨基酸残基及其对应的DNA和RNA上的碱基位点，也可以是包含有多个氨基酸残基的序列区域以及它们所对应的DNA和RNA上的多个碱基组成的序列区域。“突变位点”的选择既可以根据蛋白质分子三维结构信息，也可以根据如序列信息、二级结构信息等等所有有用的信息。

5.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是其中的“随机重复递推式基因序列突变”中“随机”的主要过程为：在确定了突变位点之后，对编码蛋白质的DNA序列或RNA序列进行改造。对于待突变点，既可以将DNA序列或RNA序列中代表某一氨基酸的三联密码子更换为代表另一氨基酸的三联密码子，也可以更换为随机密码子，即：在之后的转录并翻译成蛋白质分子的过程中，在使用随机密码子的位置处，加入多肽链的氨基酸的种类是随机的。这样，就可以构建成一个随机序列文库，其特点在于：在理性选择的位点处产生了随机的序列信息。对序列上的特定位点进行改造(如更换密码子)的常用方法包括：重叠延伸PCR法和大引物PCR定点突变法、全基因合成法合成包含特定突变的全序列、限制性内切酶切除待突变区域后使用连接酶加入目的突变序列等等。对于“将其代表某一氨基酸的三联密码子更换为代表另一氨基酸的三联密码子”这一情况，可以直接将改造后的序列连上表达载体，转化宿主菌，表达出目的蛋白，并直接对目的蛋白的活性和理化特性进行检测，得知目的蛋白是否按照意愿产生正向进化。若未产生正向进化，则说明在突变位点替换的氨基酸种类不合适，此时返回该步骤，在该位点替换其它种类的氨基酸。对于构建随机文库这种情况，可以将文库中的基因连接于表达载体，转化入宿主菌，构建待筛选克隆文库。可以使用培养皿平板法、多孔板法、摇瓶法等等方法培养宿主菌并诱导其表达，之后逐一检测表达产物的活性或者理化特性，选择能产生正向进化蛋白质分子的宿主菌，保存。此为第一轮定向进化。

6.根据权利要求1所述的一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其特征是其中的“随机重复递推式基因序列突变”中“重复递推式”的主要过程为：在第一轮定向进化完成后，以第一轮定向进化筛选到的结果(目的蛋白质)作为起点，重复之前的定向进化步骤，进行第二轮定向进化，将第二轮定向进化的结果(目的蛋白质)作为起点，重复之前的定向进化步骤，进行第三轮定向进化，依次类推，至第n轮定向进化(n为正整数)。即迭代递推重复式定向进化。该方法可以累积正向进化。