[发明专利]白唇竹叶青蛇毒降纤酶及其制备方法和在制药中的应用

说明书

技术领域

本发明提供一种白唇竹叶青蛇毒降纤酶及其制备方法和在制药中的应用，属于生物医学领域。

背景技术

在蝰亚科、蝮亚科和眼镜科等蛇毒中存在着一类能直接溶解纤维蛋白(原)的酶，简称降纤酶，是一种既能溶解纤维蛋白原，又能溶解纤维蛋白的纤维蛋白溶解酶。蛇毒降纤酶不存在无活性的酶原形式，而存在有活性的蛋白水解酶，不需要激活剂激活。因此可直接作用于形成血栓的纤维蛋白，将血栓快速溶解，改善患者的临床症状；通过溶解血浆纤维蛋白原，降低血液黏度，抑制血栓形成，防止再次梗塞。

根据其结构特点，蛇毒降纤酶又可分为丝氨酸蛋白酶(Serine proteinase)和金属蛋白酶(metalloproteinase)。丝氨酸蛋白酶的降纤活性可被常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂如二异丙基氟磷酸酯(DFP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)所抑制，但不被EDTA所抑制，而金属蛋白酶的降纤活性可被EDTA所抑制。大多数降纤丝氨酸蛋白酶优先裂解纤维蛋白原的Bβ2链，而对Aα2链则只有很低的裂解活性；而大多数降纤酶是金属蛋白酶，优先裂解纤维蛋白原的Aα2链，而对Bβ2链则只有较低程度的裂解。

现在临床使用的溶栓药主要是链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活物，这类药物的共同特点是间接作用，且起效慢。我们首次从我国产的白唇竹叶青蛇的毒液中分离纯化的降纤酶与目前临床使用的t-PA(组织纤溶酶原激活剂)、尿激酶、链激酶等溶栓制相比有许多优点：白唇竹叶青蛇毒降纤酶是一种金属蛋白酶，其活性不被血液中丝氨酸蛋白酶抑制剂所抑制；由于其不激活生理纤溶酶可避免，如与生理纤溶酶形成相关的血小板活化等副作用；底物专一，半衰期长。这些特性均显示了白唇竹叶青蛇毒降纤酶作为一种强力溶栓剂的潜在价值。但是在目前，还没有一套从我国白竹叶青蛇毒液中提取纯化白唇竹叶青蛇毒降纤酶行之有效的方法以及对其药效的确认。

发明内容

本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种具有较强的水解纤维蛋白原活性的白唇竹叶青蛇毒降纤酶及其制备方法和在制药中的应用。

为了本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

唇竹叶青蛇毒降纤酶，我们从中国产的白唇竹叶青蛇的毒液中分离得到的一种金属蛋白酶，其具有同时水解纤维蛋白原的α链和β链的活性，金属蛋白酶抑制剂EDTA可抑制其活性，但巯基乙醇和丝氨酸蛋白酶专一性抑制剂PMSF不能抑制其活性，其在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量还原和非还原条件下为66300道尔顿。

唇竹叶青蛇毒降纤酶的制备方法，收集白唇竹叶青蛇毒液，集中后冷冻干燥制得粗毒冻干粉，取白唇竹叶青蛇毒粗毒冻干粉1～5g，溶于4～6ml pH 7.5～8.5，0.04～0.06mol Tris-HCl缓冲液中，用离心机以3000～5000r/min离心8～12min，取上清液，经DEAE-Sephadex A-25离子交换层析，用浓度范围0.01～0.6mol/L NaCl1000ml的0.04～0.06mol Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，洗脱流速为0.20～0.30ml/min，收集所得I峰洗脱液冷冻干燥，(该I峰为DEAE-Sephadex A-25离子交换层析图谱左边数过来第一个峰)，溶解于3ml0.01～0.6mol/L Tris-HCl缓冲液中；经DEAE-Sephadex G-100凝胶层析，用pH7.5～8.5，0.01～0.02mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，速为0.11～0.17ml/min，收集分离出的I峰洗脱液(G-100凝胶层析柱分离出的I峰为Sephadex G-100层析图谱左边数过来第一个峰)，冻干燥后，再经CM-Sephadex C-25阳离子交换层析，用pH 5～6.5，浓度为0.009～0.011mol/L的NaAc缓冲液洗脱，洗脱流速为0.25ml/min，取主峰即可。然后用高效液相色谱(HPLC)和SDS-胺凝胶平板电泳(SDS-PAGE)鉴定其纯度，分子量测定采取SDS-胺凝胶平板电泳测定。

白唇竹叶青蛇毒降纤酶作为制备治疗血栓疾病的应用。

下面用发明的白唇竹叶青蛇毒降纤酶的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有益效果：