[发明专利]蕨菜多糖的提取分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖的提取分离方法，更具体地，本发明涉及一种蕨菜多糖的提取分离方法。

背景技术：

蕨菜是可作食用的蕨类植物的统称。野生蕨菜自古以来就被用作菜蔬和度荒的食品，我国最早的诗经中《诗召南草虫》记载：“陡彼南山，言采其蕨”。北魏贾思勰的《齐民要术》及明代李时珍的《本草纲目》均有较多的记载。由于野生蕨菜具有特殊的清香口味，又极少受到污染，所以倍受人们青睐，已成为我国重要出口土特产品之一，在国外享有“山珍之王”的美称。蕨菜为传统野菜，营养极为丰富，含有大量的氨基酸以及无机元素，其中有8种人体必需氨基酸，其胡萝卜素和维生素C的含量均高于番茄、茄子和黄瓜。不仅蕨的嫩叶可供食用，其地下根状茎富含淀粉，可提取食用。我国野生蕨菜资源丰富，极具开发价值，但目前绝大多数尚未被利用。有关蕨菜化学成分的测定、药理作用的特点、营养保健的价值，近年有一些报道，但对于蕨菜多糖的提取方法和特别是分离纯化则尚未报道，有些方法提取出的蕨菜多糖含色素很多，灰色粉末状的蕨菜粗多糖水溶性差，提取率不高，纯度也很低。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述存在的问题，提供一种科学地提取蕨菜多糖，并能保持蕨菜多糖的生物活性，最大限度地提高蕨菜多糖提取率的方法。

本发明的多糖的提取分离方法是利用多糖、糖蛋白溶于水的特性，用热水浸提法，并用乙醇沉淀的方法分离，最后用阴离子交换层析和凝胶排阻层析纯化多糖。具体包括以下步骤：

1)取蕨菜粉碎过40～80目筛，用2～4倍90％乙醇在80～100℃回流浸提0.5～2小时；

2)去掉乙醇后加水在60～90℃水浴上提取2～3次，每次2～4小时；

3)将上述浸提液离心4800rpm，10min，弃沉淀，取上清液；

4)用Sevage方法脱去上清蛋白：在上清液中加等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，充分震荡后静置10分钟，4000～6000rpm离心10分钟，反复多次直至完全脱去蛋白。

5)乙醇沉淀的方法分离：将脱去蛋白的溶液在50℃～60℃减压蒸馏浓缩，加入2～3倍于该溶液体积的乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，干燥，得粗多糖；

6)阴离子交换柱和凝胶排阻层析纯化多糖：取粗多糖溶于去离子水或pH值为7～8，浓度为10～50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，制成饱和溶液，4800rpm离心弃沉淀，将上清样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，以上述的Tris-HCl为洗脱液，再用浓度为0.2～0.8mol/L NaCl梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测样品在490nm的吸收值，收集单一峰，透析去离子后上样于Sephacryl S-400HR或Sephadex G-100柱，以去离子水进行洗脱。用苯酚硫酸法跟踪检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确定蛋白的含量，收集单一峰，冷冻干燥得纯化的单一蕨菜多糖。

本发明中，若采用新鲜蕨菜，则新鲜蕨菜与蒸馏水以重量比1∶3的比例混合，若采用干蕨菜粉，则干蕨菜与蒸馏水以重量比1∶15～25的比例混合。

步骤6)中所述的用于蕨菜多糖的检测苯酚-硫酸法为：将0.2ml样品用蒸馏水稀释到2ml，加入6％的苯酚溶液1ml，再加入5ml浓硫酸，反应30分钟后再用紫外分光光度计在490nm处检测OD值。

优选地，本发明步骤2)中水的用量为20倍于样品的重量，温度在60～75℃提取2次，每次2.5～3.5小时；优选地，提取温度是62～68℃提取2次，每次2.5～3.5小时；更优选地，是65℃，提取2次，每次3小时。

本发明步骤5)中在-60℃真空冷冻干燥8～12小时

本发明步骤6)中采用流动水透析；Tris-HCl和去离子水洗脱的流速控制在2ml/min。

本发明方法以干蕨菜为原料，提取、纯化各种蕨菜多糖、糖蛋白，多糖的提取率高，经优化后的提取率为2.02％，经过纯化的多糖纯度在98％以上；除色素彻底、水溶性好，并且能保持多糖和糖蛋白的生物活性。本发明方法简单合理，适合于大规模生产，且能普遍应用于各种蕨类植物多糖和糖蛋白的分离纯化。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不局限于此实施例。

实施例1：

1.蕨菜粗多糖的制备