[发明专利]一种制备脱氧核苷酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及脱氧核苷酸的制备方法。

背景技术

三磷酸脱氧核苷是DNA分子的结构基础。作为各种DNA聚合酶的反应底物，是DNA合成、DNA序列分析、基因分析、定点突变、各种聚合酶链式反应(PCR)等体系中必不可少的组成部分。而上述技术是现代生命科学高速发展的产物，在分子生物学、生物化学、药学、医学等领域起着至关重要的作用。尤其是PCR技术，因其具有操作简单、周期短、反应灵敏等特点，在分子克隆、生物工程、生物医药研发、遗传和传染性疾病诊断、法医鉴定、亲子鉴定等领域得到越来越广泛的应用。生物技术尤其是PCR技术的迅猛发展及其应用领域的迅速扩大，使国内外对三磷酸脱氧核苷系列产品的需求日益增长，产品市场前景非常广阔。

单磷酸脱氧核苷是制备三磷酸脱氧核苷的必须中间体。传统的单磷酸脱氧核苷制备方法是通过生物酶促水解法或化学水解法水解脱氧核糖核酸获得单磷酸脱氧核苷。具有底物转化率低，产物收率低，成本高，反应条件不易控制，产物复杂等缺点。

发明内容

本发明提供一种制备脱氧核苷酸的方法，以解决传统的通过生物酶促水解法或化学水解法水解脱氧核糖核酸获得单磷酸脱氧核苷时，存在的底物转化率低、产物收率低、成本高、反应条件不易控制、产物复杂的问题。本发明采取的技术方案是：

将氨基葡萄寡糖和过渡态金属离子按1∶1～1∶10的摩尔比加入到反应体系中，使氨基葡萄寡糖的浓度达到0.1μM～10.0μM，加入水解底物脱氧核糖核酸至终浓度1mg/mL～100mg/mL，以缓冲液控制反应体系pH 4～11，于20℃～40℃反应1小时～12小时；反应液用去离子水稀释1～100倍后用离子交换层析介质进行吸附，然后经平衡，除杂，洗脱，获得目的物dAMP、dCMP、dGMP和dTMP。

本发明中，反应体系中氨基葡萄寡糖的分子量为340～984Da；

本发明中，反应体系中所用过渡态金属离子为Fe²⁺、Cu²⁺或Co²⁺；

本发明中，所用缓冲液为醋酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，终浓度为20mM～200mM。

本发明克服了传统单磷酸脱氧核苷制备条件苛刻、产物复杂和纯化步骤繁多等缺点，提供了一种可以简单、高效地制备单磷酸脱氧核苷的方法。

本发明利用氨基葡萄寡糖脱氧核糖核酸模拟酶水解脱氧核糖核酸获得目的产物；同时充分利用目的产物与反应体系中共存杂质之间的物理、化学及生物学性质上的差异，实现仅通过一步纯化获得高纯度的目的产物。

本发明优点在于采用氨基葡萄寡糖脱氧核糖核酸模拟酶水解脱氧核糖核酸获得目的产物，该模拟酶与传统的生物酶相比具有分子量小，结构简单，活性高，pH和温度适应范围广，不易失活等优点。本方法同传统方法相比，具有反应时间短，体系pH和温度范围广，容易控制，效率高。

具体实施方式

实施例1

反应体系采用醋酸缓冲体系，pH4.0。向200mM醋酸缓冲液中加入：水解底物脱氧核糖核酸至终浓度1mg/mL，Cu²⁺至终浓度1μM，氨基葡萄寡糖至终浓度0.1μM，使终反应体积为5mL，反应体系中氨基葡萄寡糖的分子量为340～984Da，反应温度为40℃。反应12小时，用去离子水将反应液经过直径为2.5×25cm阴离子层析柱进行吸附，流速为2mL/Min，用去离子水平衡以去除未吸附的杂质，然后用1.8mM HCl去离子水溶液洗脱dCMP，用2.8mM HCl去离子水溶液洗脱洗脱dAMP，用36mM NaCl去离子水溶液洗脱dTMP，用5mM HCl、20mM NaCl去离子水溶液洗脱dGMP。最后以浓度为1M的盐酸和1M的氢氧化钠按先酸后碱的顺序对离子交换介质进行再生，再生完成后用去离子水洗阴离子层析柱至pH中性。

实施例2