[发明专利]一种快速检测沙门菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及种特异性引物在环介导等温DNA扩增反应检测沙门菌中的用途。这些引物可用于检测食品中沙门菌的污染。

背景技术

沙门菌是(Salmonella spp.)是一类广泛分布于自然界，可使人和动物发病的具有极大危害的革兰氏阴性肠道致病菌，能引起人胃肠炎、伤寒、败血症等症状。目前全世界已分离出2000多个血清型，我国已发现216个。根据国家食源性疾病监测网的统计资料显示，食品中污染的微生物是引起食源性疾病的主要因素之一。近十年来，在我国由微生物引起的食源性疾病事件中，沙门菌始终是最常见和最主要的病原因子，尤其在生肉及熟食制品中。因此，检测沙门菌对有效控制其传播和预防食物中毒非常重要。

目前鉴定沙门菌主要有细菌学检查和免疫学方法。前者作为我国国标检测沙门菌的方法，虽然结果可靠，但是操作烦琐、耗时，已经不能满足大量样品的检测需要，而后者虽然可以快速检测，但容易出现假阳性。

新兴的分子生物学的方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、依耐核酸序列的扩增(NASBA)，自主序列复制(3SR)以及链置换技术(SDA)等，每种扩增技术都有自己的创新处来启始的DNA合成。例如，PCR利用双链DNA的热变性来促进下一轮的DNA的合成。3SR和NASBA利用一系列的转录和反转录反应消除热变性来扩增靶序列。同样的，SDA利用一组限制酶酶切来消除热变性步骤，用修饰的核酸作为底物来进行链置换DNA合成。这些方法都能扩增靶核酸到相似的数量级，都有较高的检出限以及都在一个小时左右，但是它们仍然有一些缺陷不能克服。它们有的需要精密的仪器来扩增，有的因为对靶序列的选择特异性不高而需要精细的方法来检测扩增产物。尽管操作简单，但需要高精度的热循环仪使得PCR这一有力的技术没有被广泛的应用。另一方面，不使用热循环仪的NASBA和3SR，在特异性上又大打折扣，主要是由于必须用一个相对较低的温度40℃来进行扩增。SDA利用四种引物在等温条件下扩增很大程度上克服了这些缺陷，但是仍然存在薄落的环节：必须利用昂贵的修饰核苷酸作为底物来进行扩增反应。

综合以上原因，研究一种快速、准确、简便的方法来检测沙门菌是非常必要的。

本发明选用沙门菌高度保守的invA基因，设计了4条能在60℃～65℃的温度条件下扩增沙门菌一段DNA序列的特异性引物。invA是编码沙门菌侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门菌特有的。该扩增反应依赖于一组针对靶基因的引物，包括一组内引物FIP和BIP，以及一组外引物F3和B3，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的大片段，在64℃左右的恒温条件下即可完成对靶基因的特异性扩增。由于其针对invA基因的6个区段，所以特异性高；且其反应温度恒定，不需要PCR仪，仅需一个水浴锅即可完成；另外，在反应过程中，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，能产生一种焦磷酸镁的沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就可判定扩增结果，无需进行凝胶电泳。

实验证明，通过该法检测食品中污染的沙门菌，其特异性良好，操作简单，无需昂贵仪器和试剂，且灵敏度比常规PCR高。

主要参考文献

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