[发明专利]牛分支杆菌免疫原性分泌型蛋白的筛选鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛分支杆菌免疫原性分泌型蛋白的筛选鉴定方法，利用生物信息学技术和实验生物学技术，对牛分支杆菌中具有强免疫原性的分泌型蛋白质分子进行筛选鉴定，可为防治牛结核病提供新的候选疫苗分子。

背景技术

目前，在牛结核病的控制方面存在的最大问题就是尚无可实用的疫苗应用。目前正在研究的疫苗包括亚单位疫苗、基因疫苗、减毒活疫苗和卡介苗等。卡介苗由于其检测过程中假阳性的比率很高而被禁止在国内牛群中应用。因此，开发新型安全、高效的疫苗已成为控制牛结核病的研究热点。研究证明机体主要依靠细胞免疫抵抗结核杆菌的感染，而结核杆菌的分泌蛋白是宿主对分支杆菌(MTB)感染早期所能识别的重要抗原，可引起T淋巴细胞及B淋巴细胞免疫反应。MTB的分泌蛋白大多存在于培养滤液中，大多数分泌蛋白具有免疫原性，可以作为研制亚单位疫苗的候选分子，因而受到相关研究领域的高度重视。

在研究MTB分泌蛋白时，多年来一直沿用传统的蛋白质分离分析技术，这些技术手段受到仪器的限制，而且操作复杂，成本高，制约了对牛分支杆菌分泌型蛋白质的发掘和功能研究。近年来兴起的生物信息学技术已经在重要功能分子分析发掘中显示了明显的优势。MTB分泌蛋白的结构特点是新生肽链的N末端具有典型的信号肽(signal peptide)特征。信号肽是某种分泌蛋白质及细胞膜蛋白质等，以前体物质多肽的形式合成，其N末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列，这种氨基酸序列称为信号肽或信号序列(signal sequence)。信号肽所具备的一些数量化特点为计算机自动化分析预测提供了可能，也就是用生物信息学测基因组。但是这只能作为分泌蛋白的一个初选，因为分泌蛋白和膜蛋白都含有信号肽序列，不同的是分泌蛋白无疏水的跨膜区，而膜蛋白还有一个以上的疏水跨膜区。根据这一差异可进一步对分泌蛋白筛选。

研究表明，利用信号肽分析手段对Gen Bank(基因库)中的细菌的基因组序列进行分析，从而找出能够编码分泌型蛋白的基因片段，利用同源性原理设计引物，将其克隆表达，可以发掘免疫原性蛋白分子，较传统方法的效率和速度都大为提高。目前尚未有相关的技术公开报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种牛分支杆菌免疫原性分泌型蛋白的筛选鉴定方法，筛选得到的基因即可以包含信号肽结构、不含跨膜结构，又具有免疫原性，同时与相应的分子结构具有相当的同源性，以此为依据设计引物，可以高效率地获得目标分子。

为实现上述目的，本发明首先通过分析信号肽结构将分泌性蛋白和膜蛋白从其它蛋白质组中区分出来，再从已筛选出的蛋白中寻找疏水跨膜螺旋，凡含疏水跨膜螺旋的认定为膜蛋白，以此区分分泌性蛋白和膜蛋白；然后将与禽分支杆菌同源性小于36％的牛分支杆菌蛋白分子筛选出来作为候选蛋白，再对候选蛋白编码基因进行引物设计，以牛分支杆菌DNA为模板，，进行PCR扩增、酶切，构建重组质粒并进行诱导表达，再按分子克隆方法进行蛋白质印迹分析，确认获得牛分支杆菌免疫原性分泌型蛋白质。

本发明方法具体包括如下步骤：

1、对基因库中牛分支杆菌基因组的蛋白编码基因进行序列分析，根据信号肽序列特征、信号肽位置及切割位点，将mean S-score大于0.5的蛋白从蛋白质组中区分出来，预测为存在信号肽的蛋白，其中包含分泌蛋白及可能被错误预测为分泌蛋白的膜蛋白。

2、从已筛选出的蛋白中寻找疏水跨膜螺旋，有跨膜疏水区的蛋白是膜蛋白，予以排除，得到分泌蛋白。

3、对得到的分泌蛋白进行同源性分析，将与禽分支杆菌同源性小于36％的牛分支杆菌蛋白筛选出来，作为候选蛋白。

4、对候选蛋白编码基因进行引物设计，以牛分支杆菌基因组DNA为模板，对候选蛋白基因进行PCR扩增，将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，并进行纯化、回收，得到目的片断。用限制性内切酶对目的片断和原核表达载体进行双酶切，酶切完毕后，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后回收酶切片断。

5、将酶切片断和原核表达载体进行连接，构建重组质粒；将重组质粒转化至E.coli BL21感受态细胞中，过夜培养，挑取单菌落，接种于含抗生素的培养液，37℃过夜；用PCR对菌落进行扩增，对扩增所得产物进行DNA测序鉴定，确认重组质粒构建正确。