[发明专利]牛分支杆菌免疫原性分泌型蛋白的筛选鉴定方法

权利要求书

1、一种牛分支杆菌免疫原性分泌型蛋白的筛选鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：

1)对基因库中牛分支杆菌基因组的蛋白编码基因进行序列分析，根据信号肽序列特征、信号肽位置及切割位点，将mean S-score大于0.5的蛋白从蛋白质组中区分出来，预测为存在信号肽的蛋白，其中包含分泌蛋白及可能被错误预测为分泌蛋白的膜蛋白；

2)从已筛选出的蛋白中寻找疏水跨膜螺旋，有跨膜疏水区的蛋白是膜蛋白，予以排除，得到分泌蛋白；

3)对得到的分泌蛋白进行同源性分析，将与禽分支杆菌同源性小于36％的牛分支杆菌蛋白筛选出来，作为候选蛋白；

4)对候选蛋白编码基因进行引物设计，以牛分支杆菌基因组DNA为模板，对候选蛋白基因进行PCR扩增，将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，并进行纯化、回收，得到目的片断；用限制性内切酶对目的片断和原核表达载体进行双酶切，酶切完毕后，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后回收酶切片断；

5)将酶切片断和原核表达载体进行连接，构建重组质粒；将重组质粒转化至E.coli BL21感受态细胞中，过夜培养，挑取单菌落，接种于含抗生素的培养液，37℃过夜；用PCR对菌落进行扩增，对扩增所得产物进行DNA测序鉴定，确认重组质粒构建正确；

6)将构建正确的重组质粒进行诱导表达，每隔两小时取一次表达后的菌液，经离心，煮沸，进行12％SDS-PAGE分析，按分子克隆方法，电转至硝酸纤维膜上进行免疫染色，经小牛血清白蛋白封闭后，依次加入兔抗牛分支杆菌阳性血清的稀释液、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的抗体的稀释液，最后在3，3-二氨基联苯胺溶液中显色，出现与预计蛋白分子量一致的蛋白条带，即为牛分支杆菌具有免疫原性的分泌蛋白。