[发明专利]同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于检验检疫技术领域，具体涉及一种同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒。

背景技术

禽流感(欧洲鸡瘟、真鸡瘟)与新城疫(亚洲鸡瘟、伪鸡瘟)同属国际兽医局指定的甲类烈性禽类传染病，都具有传播快、发病急、死亡率高的特征，在国家动物防疫法上同被列为一类动物疫病。禽流感(记为AIV)与新城疫(记为DNV)的症状相似、病理进程难以区分，而社会危害相差悬殊：目前对这两种疫病采取的控制及扑杀的规定不同，禽流感特别是高致病性禽流感如H5N1、H7等可以突破种群传播的界限，能够导致易感人群发病，具有极高的致死率；而新城疫属于严格的禽类传染病，一般对人不致病。所以一旦误诊误判，后果将不堪想象。同时，并非所有的禽流感均可传播到人群，只有高致病性禽流感(目前所知主要为H5N1、H7N7、H7N2、H7N3、H9N2等亚型)具备这种能力，其余亚型的禽流感一般对人不致病或低致病(轻微感冒等)，例如常见的H9亚型禽流感。虽然禽流感与新城疫症状相似，二者的病原学相差很大，禽流感病毒属于正粘病毒科甲型流感病毒属(基因组为分节段的RNA，容易发生重排)，不同亚型的H基因及N基因存在规律性差异；而新城疫病毒是副粘病毒科(基因组为单股不分节的RNA)，因此，可以借助基因诊断等分子生物学手段进行快速准确的鉴别诊断。

新城疫和禽流感对养殖业可造成致命性打击，高致病性禽流感已造成多人感染与死亡，例如1997年H5N1导致香港18人感染6人死亡，2003年又导致2人感染1人死亡；2004年1-10月则导致越南、泰国33人死亡。1993年美国宾州暴发禽流感，花6000万美元用于捕杀1700万只鸡；1995年墨西哥暴发禽流感，1800万只鸡被淘汰，3200万只鸡被封锁，1.3亿只鸡紧急接种疫苗，直接经济损失10亿美元以上。而在防控禽流感的诸多环节中，最重要的是要快速准确诊断，及时圈定封锁疫区以免疫情扩散。传统禽流感、新城疫的诊断方法为鸡胚培养试验、琼脂扩散试验、病毒中和实验、酶联免疫吸附试验等，采用红细胞血凝抑制试验及神经氨酸酶抑制试验来确定亚型。传统检测手段耗时长，难度大，操作复杂。因此，研制一种灵敏度高、特异性强、准确性高的“同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒及其H5、H7、H9、N1亚型的快检试剂”具有重要的公共卫生意义和现实意义。

关于禽流感核酸检测的专利申请众多，但这些申请均为单项目检测，或多项目PCR-电泳法检测，或H5、H7、H9亚型的多重荧光PCR检测，费事费力，不能实现新城疫与禽流感通用型、H5、H7、H9、N1等的同步鉴别检测。涉及禽流感与新城疫同步检测的中国专利申请只有一件，申请号为200510042527.1(名称：复合定量聚合酶链反应检测禽流感和新城疫病毒的方法)，但其采用非探针技术而为荧光染料溶解曲线分析法，缺点是特异性差，不能将禽流感分型；究其原因是特异性差的荧光染料溶解曲线分析法不能用作多项目研究，否则过多扩增杂带干扰导致Tm无法分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能同步鉴别鉴别诊断禽流感病毒和新城疫病毒的核酸检测试剂盒。其中禽流感病毒还包括其亚型如亚洲主要流行的H5、H7、H9、N1，通过本试剂盒的检测，可确定病原体是禽流感病毒还是新城疫病毒，并能确认是高致病型禽流感(H5、N1、H7)还是其它低致病型禽流感(H9及除H5、H7、H9之外的其它亚型)。

本发明提供的核酸检测试剂盒的工作原理为：通过硅胶吸附柱法提取病毒RNA，高浓度胍盐制成的裂解液在操作开始就加入到待检标本中，使可能潜在的病毒颗粒裂解变性得以灭活，病毒核酸释放出来，在有机试剂如乙醇的存在下病毒核酸吸附于硅胶膜上，经过两次洗涤，除去杂质，低盐或纯水制备的洗脱液将病毒核酸洗脱下来，用作RT-PCR TaqMan荧光探针法检测的模板。

本发明提供的核酸检测试剂盒，其检测试剂包括用于硅胶吸附柱法提取病毒RNA的提取试剂和用于提取试剂RT-PCR TaqMan荧光探针法检测的核酸检测扩增试剂。此外，还可包括供提取病毒RNA用的固体组织标本的处理液。其中：

固体组织标本预处理液的配方如下：

0.8-2M GTC，0.1-0.8M硫氰酸胺，0.05-0.5M NaOAc PH 5.0，2-10％甘油，30-50％苯酚(或使用Trizol/Trizol LS试剂，Invitrogen.Cat No.10296010)，用来研磨肉类标本(液氮处理也可)。

提取试剂的组成和配方如下：