[发明专利]实时荧光定量PCR检测柯萨奇病毒A16型的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早 期、快速诊断柯萨奇病毒A16型感染的试剂盒。通过本发明的试剂盒实现对粪便、血清、咽 拭子、脑脊液、疱疹液等样品中的柯萨奇病毒A16型的检测和定量分析。

背景技术

柯萨奇病毒A16型(CA16)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成 员，柯萨奇病毒分为A、B两组，其中A组又分24个血清型，B组分6个血清型。各血清型引起的 临床综合病征，由于侵犯的器官不同而表现各异，重则可造成死亡，妊娠期感染可引起非麻 痹性脊髓灰质炎性病变，并致胎儿宫内感染和致畸。柯萨奇病毒A型感染儿童多见，成人感 染占21.7％(Robinson，1958)。临床表现除上述外，主要特点为急性发烧、皮疹。脑膜脑炎 伴有Guillain-Barré综合征和急性病毒性心肌病。

自1959年由人类肠道病毒(enterovirus，EV)导致手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)报道以来，HFMD已经在全球多次暴发。在我国，1985年以前柯萨奇病毒A16 型(CA16)是该病的唯一病原，1983年天津暴发柯萨奇病毒A16型引起的手足口病，5～10月 发病7000余例；而近年来手足口病暴发流行的主要是肠道病毒71型(EV71)和CA16引起，流 行病学研究表明二者常常伴随流行引起手足口病暴发。CA16往往是主要的病原，常常超过感染 总人数的60％。二者在遗传学上密切相关。

通常情况下，EV71与CA16引起的手足口病在临床症状等方面难以区别，而目前CA16的 常规诊断方法还是病毒分离培养、中和抗体检测等方法，这些方法费时、费力，均不能提供 一个快速的诊断工具，然而与肠道病毒相关的急性症状可发展迅速，尤其是在病毒流行期间， 需要同时快速处理大量样本的，但是市面上还没有一个可用的诊断试剂盒。因此，开发早期、 快速、特异、敏感的检测试剂盒非常必要。

近年来，随着分子诊断技术的飞速发展，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术已经广泛 应用于RNA病毒基因水平的研究，也给微生物的快速鉴定提供了可能。RT-PCR技术克服传统方 法费时、费力且无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要的缺点，已成为RNA病毒快速 诊断的重要手段。一步法RT-PCR只要加入RNA和特异性引物即可实现在同一反应管内连续进行 RNA→cDNA→PCR反应，中途不需加入任何试剂，在处理大量样品时易于操作，有助于减少残 余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低 可以达到0.1pg总RNA。

实时荧光PCR技术是二十世纪末迅速发展起来的一种核酸检测技术，TaqMan PCR技术 是实时荧光PCR的一种，与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧 光报告基团和淬灭基团的探针。与普通PCR相比，TaqMan PCR技术具有如下优点：通过对扩 增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点 分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；将DNA扩增 与检测过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程大 大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而 减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配 对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的 检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

CA16是引起儿童手足口病的主要病原体之一，由于还没有成熟的用于该病毒筛查和诊断 的病毒核酸检测试剂盒，严重影响了对该种病毒的诊断和流行监控。本发明设计的试剂盒通 过对CA16核酸进行直接检测和定量研究，不仅对于了解患病程度、预测、评价治疗效果有十 分重要意义，而且有利于儿童手足口病的预防和控制。

发明内容

本发明涉及检测粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等样品中的CA16病毒存在的试剂 盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断CA16病毒感染的试剂盒。