[发明专利]基于环介导等温扩增技术的嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法

权利要求书

1、一种嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒，其特征在于由两对引物、Bst DNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上七种液体分别置于容器中，

上述两对引物为：

外引物F3：TCTATTGAAATAGCACTTAAGCT；

外引物B3：TGGATTCCGATCGGGATG；

内引物FIP：GCTGTTCCATAACTGCTCACAATTTttttAATTTAGAGTCTTCATACGACTGA；

内引物BIP：TTAGAAGTAAGTCGAAATGCGAGTGttttGTATTTCATTGCCAGCCTG；

每1L反应液中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-HCl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol；

每1L样品预处理液中含有10～20mmol pH 8.0的Tris-HCl、1～2mmol EDTA和10～12ml Triton X-100；

上述阳性对照为嗜肺军团菌基因组DNA。

2、根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述的显色液为SYBRGreen I或EvaGreen。

3、根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述每1L样品预处理液中含有20mmol pH 8.0的Tris-HCl、2mmol EDTA和12ml TritonX-100。

4、根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述每1L反应液中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl、12.5mmol氯化钾、12.5mmol硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.25mol。

5、根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述稳定液为石蜡油。

6、一种检测嗜肺军团菌的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行：

(1)将待测样品经滤膜过滤，洗脱后，于离心管中离心，去上清，沉淀中加入样品预处理液并混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心后，上清即为样品模板DNA；

(2)在反应管中加入反应液38～40体积％，Bst DNA聚合酶大片段0.9～1.8体积％，稳定液52～54.5体积％，样品模板DNA 4.5～9体积％，恒温反应；

(3)在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。

7、根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(1)中，滤膜孔径为0.22μm～0.45μm。

8、根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(2)中，恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。