[发明专利]HLA-DQB1基因分型DNA微阵列芯片试剂盒

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及DNA微阵列芯片试剂盒， 该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原DQB1(HLA-DQB1)基因进行分型 检测。

背景技术

HLA(Human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)是人类主要组织相容性系统。组织相容性 是指不同个体间进行组织或器官移植时，供者和受者双方接受的程度。供受者组织不相容引 起的反应，被证实是一种免疫反应，它是由细胞表面同种异型抗原诱导的，这个代表个体特 异性的抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中起主要作用的抗原称主要组织相容性系统 (MHS)，HLA(人类白细胞抗原)就是人类的主要组织相容性系统。HLA基因复合体位于人 类第6号染色体6p21.3区域，具有高度单核苷酸多态性(SNPs)。HLA存在多个基因座位， 每个基因座位有可以分为多种型别、亚型和等位基因。

HLA的生物学和医学意义包括免疫学反应、器官移植排除反应和疾病关联性等等。在疾 病关联性方面，研究发现HLA-DQB1的某些亚型与多种疾病存在密切的关联性， HLA-DQB1*0602的基因频率在Graves病合并2型糖尿病患者组中较健康对照组明显增加， 有很强的相关性，是Graves病合并2型糖尿病患者的易感基因；DQB1*020x等位基因频率 在I型银屑病患者中显著增高，DQB1*020x等位基因与银屑病的家族遗传史及早发型银屑病 相关；DQB1*03032和DQB1*0602型儿童，幽门螺杆菌感染发展为慢性胃炎概率显著低于其 它基因型别，提示遗传保护因素的作用；DQB1*0602基因为中国发作性睡病人群的易感基因， DQB1*0401-0402基因为中国发作性睡病人群的保护基因，等等。

HLA-DQB1基因分型方法是从90年代开始发展起来的，目前主要包括PCR-SSP(PCR- 序列特异性引物法)、PCR-SSOP(PCR-序列特异性寡核苷酸探针法)、SBT(测序法)、FCM (流式法)方法。这些方法目前被西方国家的少数企业垄断，我国处于空白状态，完全依赖 进口。同时，这些方法也存在一些技术问题，比如引物过多造成检测错误、探针杂交单一温 度造成特异性降低、检测通量过小等等。

DNA微阵列法是近几年发展起来的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、 集约化、低成本、高准确性等特点，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为 一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于该技 术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分 析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量 等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的 应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序 (Sequencing by hybridization，SBH)等，为“后基因组计划”时期基因功能研究及现代医学科 学、医学诊断学的发展提供了强有力的工具。

本发明解决了我国目前HLA-DQB1^*分型检测试剂依赖进口以及目前检测方法上的弊端， 具有技术和价格双重优势，实际应用以后会产生经济和社会双重效益。

发明内容

本发明的目的是将DNA微阵列技术应用于HLA-DRQ1基因座位的基因分型检测，开发 了一种新型的基因分型检测试剂盒。

本发明所采用的技术方案是：针对HLA-DRQ1座位的第二外显子，设计一套特异性寡核 苷酸探针(表1)，采用自动点样机器人，将探针印制在一张玻片的特定区域，每张玻片印制 10个微阵列矩阵，这样就制成DNA微阵列芯片，一张芯片可以检测10个样本，再配以其它 必要的组份，如PCR引物(表2)，组成完整的试剂盒。实际检测时，取10份人基因组DNA 溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法，扩增出人基因组HLA-DRQ1基因的第二外显 子单链CY3标记片段。取DNA微阵列芯片一张，在10个杂交区分别加入10种PCR产物 2ul和杂交液8ul。将芯片放在自动杂交洗涤仪的杂交槽内，杂交温度设定为52℃，杂交时间 30分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入GenePix 4100A扫描仪进行扫描，使用分析软件对 扫描图像信号进行图像数据转换处理，经过分析产生样本基因型别结果。