[发明专利]结核分枝杆菌检测液相芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物类，具体地是涉及结核分枝杆菌检测液相芯片及其制备方法。

背景技术

由结核分枝杆菌(TB)引起的结核病是现今世界上最普遍的人类传染病之一。全世界已有1/3人口约20亿人感染了结核分枝杆菌(MTB)。每年有900万新结核病人，约300万人死于结核病。我国现有结核病人约600多万，每年还至少有113万新生结核病例发生，每年因结核病死亡人数高达25万，且75％的结核病例发生在15-50岁的青壮年当中，严重影响了我国国民经济和人口素质发展。准确及时诊断活动性肺结核，有效控制传染源，对我国的结核预防控制至关重要。早期诊断MTB感染的方法越来越显得重要。

结核病控制存在的最主要问题是结核病人或感染动物的发现率低。现有的结核病实验室诊断主要依靠细菌学检测、免疫学检测、质谱分析、PCR诊断、DNA指纹技术和基因芯片检测技术。对结核病人痰的细菌学检测是结核病诊断、治疗及评价治疗效果最可靠的标准。常规的细菌学检测方法有痰涂片法、培养法、药敏试验及根据其理化特性而建立的菌型鉴定法。涂片法是最基本的检测方法，具有简便、快速的特点，但敏感性差，平均检出率只有25％～35％，无法区分死菌、活菌。培养法周期太长，约4～8周，同时必须结合药敏试验和菌种鉴定试验才能进一步确诊，这样所需周期更长，不利于临床上结核病的诊断和治疗，加之试验过程中的影响因素很多，不易标准化，不能满足临床需要。Bactec快速培养仪检测系统虽然可缩短培养时间，但也需2-4周，而且需要特殊的仪器设备，费用昂贵，无法在基层推广应用；噬菌体检测技术虽然快速、简便，但特异性差，只能用于结核病人初筛；PCR分子生物学诊断技术快速、灵敏，是很有前途的诊断方法，但其相对成本较高，而且假阳性率较高，不能区分死菌与活菌；血清特异性抗体检测方法简便、实用，但目前所用抗原多为PPD、LAM、38kD、16kD等，这些抗原多数是分枝杆菌属所共有的，因此特异性不强。

抗原检测一直是确认或评估病原体感染及感染状况较为可靠的方法，且有早期诊断价值，在其它许多疾病如HBV、HCV、HIV、SYPHILIS诊断方面获得广泛应用。特异性抗原检测最重要的特征在于通过检测相关病原体的特异性抗原(标志物)实现。使用这一方法检测结核杆菌，必须寻找到结核杆菌特异性抗原(标志物)。

为了寻找结核杆菌特异性抗原(标志物)，过去，研究人员多从结核杆菌菌体蛋白中寻找，结果多数菌体抗原并非结核杆菌特有，而是分枝杆菌属菌共有。后来研究结核杆菌的生长，从结核杆菌培养滤液中发现了大量分泌抗原，其中一些抗原是菌体中所没有的，且为毒株结核杆菌所特有。理论上讲，由于分泌性抗原是由活的结核杆菌产生并释放到周围环境介质中，因此，检测上述多种结核杆菌的分泌性抗原能显著提高结核病诊断的阳性率，也可以通过检测分泌性抗原的存在与含量确定结核杆菌尤其是活菌存在及其生长情况。

人和动物结核杆菌在感染过程中，不同的生长环境、生长阶段，不同的感染方式，结核杆菌能启动表达不同的蛋白表达系统。研究发现，结核杆菌早期感染阶段会分泌一些小分子量抗原如ESAT-6、CFP-10等，生长阶段会释放或分泌Ag85A、Ag85B、Ag85C、MPT32、MPT53、MPT63、MPT64、MPT70、Mtb81、Mtb48、38kD等蛋白。因此，仅依靠检测一两种结核杆菌分泌抗原很难达到诊断目的。

人型(标准菌株H37Rv)是人类结核病的主要病原菌，牛型结核杆菌(M.Bovis)可经饮用未消毒的带菌牛乳引起肠道结核感染。现在为防止结核病，普遍接种的卡介苗就是减毒的牛型分枝杆菌，因此与病原菌的抗原有着很高的同源性，这一问题就成了结核杆菌需要考虑的另一关键问题。自1998年标准菌株H37Rv基因组序列公布以来，大部分编码蛋白质的功能基因得以阐明，特别是运用双向电泳和质谱技术在蛋白组水平上分离和鉴定出了一些可区别人型和牛型以及BCG，极具辅助诊断潜力的特异性蛋白质抗原，为结核病特异性诊断奠定了基础。这些主要包括：糖脂类抗原、Ag85复合物、16kDa蛋白、38kDa蛋白等。特别值得注意的是，自从1996年，Matsumoto等采用递减杂交法阐明BCG在体外处理中被删除的3个差异区域(RD区)以来，人们已经在各种BCG菌株中发现了有16个这样的区域。这些区域中所包含的一些抗原，如：ESAT6、CFP10以及MPT64等，就极有可能排除BCG对结核皮肤实验以及ELISA的干扰。