[发明专利]环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于测定微生物的试剂盒和检测方法，具体涉及一种环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒及方法。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，TOX)是猫科动物的肠道球虫，由法国学者Nicolle及Manceaux在刚地梳趾鼠的脾脏单核细胞内发现，虫体呈弓形，故命名为刚地弓形虫，该虫呈世界性分布，人和许多动物都能感染。传统的检测方法有形态学诊断、免疫学检测等。其中形态学的诊断方法最为可靠，但费时且易漏检；免疫学方法并非直接检测病原体，敏感性较低且特异性不足。以核酸扩增(Polymerase Chain Reaction，PCR)为基础的分子生物学技术的迅速发展，为弓形虫的检测提供了一种快速、灵敏的方法，但普通PCR假阳性太高，不适合临床使用，荧光定量PCR具有灵敏、准确的优点，但采用TaqMan探针法费用较高，采用荧光染料SYBR Green I可能与非特异性双链DNA结合容易产生假阳性。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)不需PCR经过的变性、复性、延伸三个阶段，可在等温条件下1小时内将目的序列扩增10⁹倍以上，因此不需特殊设备，检测时间更短、敏感性更高；同时4条特异性引物识别靶基因的6个特定区域，特异性更高，因此在微生物检测上明显优于PCR(Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，etal.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res，2000，28：E63.)。

发明内容

本发明目的是提供一种环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒及方法，解决了普通PCR存在的假阳性高和荧光定量PCR存在的费用高的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种环介导等温扩增检测刚地弓形虫的引物，由一对外引物和一对内引物组成，其序列为：

外引物1：GGGAATGAAAGAGACGCTAA

外引物2：CTGTGTACCTCTTCTCGTATT

内引物1：TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC

内引物2：ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG

其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1∶6～9。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒，其特征在于：由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，其序列为：

外引物1：GGGAATGAAAGAGACGCTAA

外引物2：CTGTGTACCTCTTCTCGTATT

内引物1：TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC

内引物2：ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG

其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1∶6～9；所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的阳性对照为含有插入刚地弓形虫一段特异序列的阳性质粒，环介导等温扩增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为10⁷拷贝/μl；所述的阴性对照为灭菌双蒸水；所述的显色剂为20倍SYBR Green I。

1、上述方案中，所述的10倍环介导等温扩增反应液(通常用“10×LAMP反应液”的形式来表示，数字“10”表示的是使用时稀释的倍数)是由200mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、40～100mM硫酸镁、4～10M甜菜碱、5～18mM的dNTPs、和1％质量百分浓度的曲拉通X-100组成。

2、上述方案中，所述的阳性质粒的制作方法为采用PCR扩增一段刚地弓形虫基因特异序列，然后装入PMD18-T载体，转化至DH5α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至10⁷拷贝/μl。

3、上述方案中，所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。

4、上述方案中，所述的mM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数。