[发明专利]卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术

说明书

技术领域

本发明涉及卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，是专用于卵黄中油脂和水溶性组分的分离工艺，属于生物技术制药中卵黄免疫球蛋白制备技术领域。

背景技术

鸡卵黄免疫球蛋白又称IgY(Yolk Immunoglobulin)，是存在于免疫后母鸡的卵黄中的一种抗体，它是由母鸡血清中的免疫球蛋白转移而来。IgY具有稳定性较好、取材方便、产量高等优点。卵黄抗体可以应用于多种抗原的多克隆抗体制备并应用于临床疾病治疗，如鸡传染性法氏囊炎、新城疫、鸭瘟、小鹅瘟、猪瘟等等。用禽卵大量制备多克隆抗体在近年来抗体制备技术已经逐渐兴起，并且已经制备了针对不同抗原的IgY，如HRV、流感病毒大肠杆菌、链球菌、梭状芽抱孢杆菌、人胰岛素、人红细胞、人血清免疫球蛋白、蛇毒和蝎毒等。

卵黄是由约48.7％的水、16.6％蛋白质和32.6％的脂类及其他组分组成，卵黄可以被看成是一个油包水的高度乳化体，IgY的开发和利用首先要将卵黄中油脂和水溶性组分进行分离，即将卵黄脱脂，所以卵黄脱脂技术一直是IgY开发的起点。高效、简单、成本低廉的脱脂方法一直是科研工作者的追求目标。卵黄脱脂研究国外起步较早，并且已经形成了许多成熟的方法，如Polson的PEG法及其改进方法(1980和1985)、Bade和Stegemann的氯仿-PEG法(1984)、Jensenius的硫酸葡聚糖法(1981)以及Nakai和Schwarzkopf的水稀释法等等。国内对卵黄脱脂研究相对较晚，许多方法是在以上方法基础上进行改进。以上这些脱脂方法虽然能保证IgY的回收率，但是应用于大批量生产却都存在一定缺陷。首先，这些方法都需要使用大量试剂甚至有毒有机溶剂，脱脂后去除这些试剂或有机溶剂必然要增加卵黄抗体的成本；其次，这些方法都需要使用冷冻离心机和冰箱，这将大大限制卵黄脱脂的批生产量，并且也增加成本。所以，卵黄脱脂技术仍需要继续的探索。

这些年来，我国科研工作者为卵黄脱脂大规模生产也进行了很多研究，并取得了一定的成果。如山东农业大学柴家前的发明专利一种提取卵黄中抗体的新方法(申请号95110458.6)中公开的甲醛脱脂法是将卵黄用缓冲液稀释后添加0.3～1.2％甲醛溶液，然后再冷冻快速溶解得到的液体即为抗体溶液。1998年山东农业大学常韦山的发明专利精制卵黄抗体的制备工艺(ZL专利号98110215.8)中公开的苯酚脱脂法是使用含2～3％的化学纯苯酚溶液与卵黄3～5∶1混合均匀，室温静置10分钟，离心后可使卵黄液分为含脂类物质的沉淀和含抗体的上清液。福州大学王辉龙在2001年发表了“聚乙二醇一步沉淀提取卵黄抗体”方法，该法是使用缓冲液稀释后再超滤达到卵黄脱脂目的。另外还有江南大学杨严俊的发明专利一种高生物活性卵黄抗体的制备方法(申请号200610040414.2)中利用天然高分子胶结合超滤技术，实现了工业化规模从蛋黄中分离提取高生物活性卵黄抗体的目的。以上专利以柴家前教授的方法最为有效、简单、成本低廉，但是甲醛的残留毒害却是该方法的致命缺点，同时使用大容量低温冰箱也影响该方法的生产量。

以上这些方法都必须使用大量无机或有机试剂、离心机或超滤设备以及都需要经过多个步骤才能达到卵黄脱脂的目的。其中许多试剂是有毒、有害的，在IgY液中残留后很难去除；仪器或设备的使用也增加了脱脂成本，同时也约束了脱脂工艺的批生产量。

发明内容

本发明的目的是，在保证卵黄中IgY活性和回收率的基础上，研究一种采用剂量少、安全、无毒的脱脂试剂，与卵黄作用后可以使卵黄中油脂与蛋白质分离，且不使用离心仪器即能自然凝集沉淀，而达到一步脱脂的方法。

为实现上述目的，本发明所用的技术方案是：使用聚乙二醇(PEG，分子量为1000～20000)或其溶液与卵黄原液或卵黄稀释液直接混合，通过机械搅拌和PEG的强吸水能力打破卵黄的乳化状态，使卵黄中油脂颗粒与蛋白质分离，然后通过静置，使卵黄油脂发生相互凝集而自然沉淀，从而达到卵黄脱脂的目的。

本发明的具体方法如下：在-5℃～50℃环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，取卵黄原液；先将卵黄原液加水做n倍稀释成卵黄稀释液，然后将聚乙二醇用卵黄原液m倍体积的水溶解，得聚乙二醇溶液；最后将卵黄稀释液和聚乙二醇溶液充分搅拌混匀，静置沉淀，沉淀后的底部即为卵黄油脂，上清液为卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液；其中0＜n＜20，0＜m＜20，且0＜n+m≤20。