[发明专利]一种对猪体核酸疫苗具有免疫增强作用的CpG基序

说明书

1、技术领域

本发明涉及生物工程技术领域或兽医生物制品领域，具体是一种对猪体 核酸疫苗具有免疫增强作用的CpG基序。

2、背景技术

近年来由于分子生物学的发展，使得疫苗学进入了一个崭新的分子免疫时 代，其标志是各种分子免疫增强剂的研究和应用。如何进一步提高传统疫苗的免 疫效果是今后努力的方向。高效免疫增强剂的应用，能全面提高机体的整体免疫 水平，增强抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率。其中，CpG基序(CpG寡聚 脱氧核苷酸)的研究是其中的焦点。CpG序列已被证实能作为疫苗的高效免疫增 强剂，使用得当能够大幅度提高疫苗的免疫保护率和机体的免疫水平。近来大量 免疫学研究证实：含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果：(1)诱导B细胞增 殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗诱生的细胞凋亡；(3)诱导单核细胞 分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤(NK)细胞的裂解活性和干扰素 (IFN-γ)分泌。

使用CpG寡核苷酸作佐剂要面临的一个较复杂的问题就是对于不同的物种 其最佳的CpG序列不同，比如对鼠免疫刺激效果最好的序列是5’-GACGTT-3’ (Zina et al，1998)，对人的刺激作用最强的是5’-GTCGTT-3’。目前开发 CpG佐剂要解决的问题是确定不同的DNA疫苗所需要的含CpG寡核苷酸的最合适 的剂量以及对不同物种具有特异性的寡核苷酸序列。

我国是世界养猪大国，2002年以来生猪饲养量在11亿头以上，在畜牧业生 产中占有较大的比重，同时养猪业也是我国部分省区的主要生产支柱和新的经 济增长点。但面对当前养猪业重大疫病发生和流行愈加复杂的形势——旧病未 除，新病又起，疫情不断，这就要求我们必须运用新的科学理论和生产技术来 发展猪用安全、高效疫苗预防和控制各种疫病的发生和流行，而免疫增强剂的 研制是疫苗研究的主要组成部分。

3、发明内容

本发明提供一种对猪体核酸疫苗具有免疫增强作用的CpG基序，可使DNA 疫苗产生更有效的免疫反应。

本发明的目的是通过以下方式实现的：人工合成一种CpG基序，其引物序 列如下：

7-A：CTCATCGATCCTATCGATCCTATCGATCCTATCGATCCTATCGATCCTATCGATGGGCC

7-B：CATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC

注：a、加黑部分需硫代修饰

CpG基序的免疫增强作用检验步骤如下：

1)选择15头健康猪(长白×大白二元杂交)，120日龄左右，体重90—115kg， 经检疫，健康状况良好。

2)外周血淋巴细胞的分离培养

采集肝素抗凝血，用PBS(PH7.4)稀释液1∶1稀释，小心叠加于2倍体积孵 育至室温的淋巴细胞分离液上，以1500rpm水平离心25min。将收集血浆层与淋 巴细胞分离液层之间的淋巴细胞层，放入含PBS(PH7.4)洗涤液5ml的试管中， 充分混匀后，以1000rpm离心10min。弃上清液沉淀用5mlPBS(PH7.4)洗涤液以 1000rpm离心10min洗两次，所得即是淋巴细胞。细胞沉淀用5ml含10％犊牛血 清的RPMI1640营养液悬浮。进行活力检测与计数。

3)脾脏免疫细胞的分离

取猪脾脏，剪碎，然后用研磨器匀浆。匀浆液经150目铜网过滤，滤液经 2000rpm离心10min收集细胞泥。用2ml红细胞裂解液悬浮，室温处理5min， 然后用10ml GKN溶液中和混匀后2000rpm离心10min。将细胞沉淀用PBS离心 洗涤3-4次，至细胞沉淀纯白色。细胞沉淀用5ml含10％犊牛血清的RPMI1640 营养液悬浮，进行活力检测与计数。

4)活力检测与计数