[发明专利]一种检测土壤纤维素酶活性的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及土壤中纤维素酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中纤 维素酶活性的分析方法。

背景技术

进入和累积在土壤中的碳水化合物是在土壤糖酶的作用下参与碳素循 环的，纤维素和半纤维素是构成碳水化合物的主要种类，纤维素至其单体- 葡萄糖的水解，是在纤维素酶复合体的多酶系统的不同酶的作用下，经若 干阶段进行的。土壤中的纤维素酶复合体由四种糖酶所组成：1，4-β-葡聚 糖内切酶、1，4-β-葡聚糖外切酶、1，4-β-葡糖苷外切酶和纤维二糖酶。它 们分别参与纤维素分解的不同阶段。通常测得的土壤纤维素酶活性，是该 种酶复合体的作用的总和。纤维素酶活性常常被用作指示土壤肥力的指标， 因为它参与土壤有机质的分解，另外，纤维素酶的活性与腐殖质的含量间 存在着相关性，在土壤纤维素的分解与腐殖质的形成间存在着一定的联系。 总的说来，土壤纤维素酶的活性反映了土壤形成的生物气候及生态学条件、 土壤生物化学过程的强度及土壤肥力水平。土壤纤维素酶活性受土壤条件、 农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响，在进行土壤肥力评价时， 常常需要测定在不同条件下的纤维素活性进行说明，因此，建立一种相对 快速准确的纤维素酶活性的检测方法具有很重要的意义。

有关土壤纤维素酶活性的测定基本都是参照周礼恺在1984年所著《土 壤酶学》一书中的方法(该方法译自Pancholy和Rice在1973年发表于Soil Science Society of American Proceedings中的方法)。该种方法步骤繁琐，且 显色物质不稳定，测定重现性较差，而后Schinner和van Mersi在1996年 所著的专著Methods in Soil Biology中对测定方法进行了改进，显色物质较 稳定，重现性较好，但同样地，其测定过程比较复杂，所耗时间较长，且 在显色过程中所需试剂氰化钾为剧毒试剂，难以获得，并增加了在测定过 程中的对操作人员的危险性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检验土壤中纤维素酶活性的分析方法。该方 法是在借鉴前人测定方法的原理基础上，对纤维素酶活性的测定步骤和终 产物的检测方法进行了改进，从而减少样品处理和试验步骤的复杂性，使 分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。其原理为使用荧光共轭物质作 为测定底物，通过酶解产生荧光物质，通过多功能酶标仪对此产物进行荧 光检测，进而计算出参与此反应的纤维素酶活性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1)以已知系列浓度的MUB溶液为标准物，采用酶标仪进行荧光检测， 发射光波长365nm，测定光波长470nm；作为测定的标准曲线；以MUB标 准溶液的系列浓度和测定的吸光值A`制作工作标准曲线，得到斜率b；

2)分别称取n份3-5g过1-2mm筛的土壤风干样品于n支粗试管中， n≥3，向各试管中加入30-50ml 0.45-0.55mol·L^-1 pH5.0-6.0的醋酸缓冲溶液， 使用微量进液枪在旋涡振荡条件下从粗试管中取100μl土壤悬液加入微孔 板中，占有n个微孔，向其中n-1个孔中加入10mM的底物溶液 (4-MUB-7-β-D-纤维二糖苷，MUB为荧光物质4-羟甲基-7-香豆素)100μl， 另一孔中加入100μl水作为无底物对照；向第n+1个孔中加入100μl底物溶 液和100μl水作为无土壤对照；25℃-30℃条件下振荡培养2.5-3.5h；分别向 孔内加入100μl 2-2.5mol·L^-1 NaOH终止反应；

3)将微孔板置入多功能酶标仪进行荧光检测，发射光波长365nm，测 定光波长470nm；在多功能酶标仪上测定荧光度为A；

4)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中MUB的浓度S，S＝A*b；

5)根据MUB的量计算出酶活性；计算公式为：x＝(S*40)/(V*b*T)

式中：x为纤维素酶活性(单位：μmol MUB·g^-1·h^-1)，S为步骤4所获得的 荧光物质的浓度，V为反应体系内的溶液总体积(单位ml)，b为称取的土 壤重量(单位：g)，T为培养时间(单位：h)。