[发明专利]一种检测土壤纤维素酶活性的分析方法

权利要求书

1.一种检测土壤中纤维素酶活性的分析方法，其特征在于：

1)以已知系列浓度的MUB溶液为标准物，采用酶标仪进行荧光检测， 发射光波长365nm，测定光波长470nm；作为测定的标准曲线；以MUB标 准溶液的系列浓度和测定的吸光值A`制作工作标准曲线，得到斜率b；

2)分别称取n份3-5g过1-2mm筛的土壤风干样品于n支粗试管中， n为≥3的正整数，向各试管中加入30-50ml 0.45-0.55mol·L^-1pH5.0-6.0的醋 酸缓冲溶液，使用微量进液枪在旋涡振荡条件下取100μl土壤悬液加入微孔 板中，占有n个微孔，向n-1个孔中加入10mM 4-MUB-β-D-纤维二糖苷 100μl，另一孔中加入100μl水作为无底物对照，向第n+1个孔中加入100μl 底物溶液和100μl水作为无土壤对照；25℃-30℃条件下振荡培养2.5-3.5h； 分别向孔内加入100μl 2-2.5mol·L^-1NaOH终止反应；

3)将微孔板置入多功能酶标仪进行荧光检测，发射光波长365nm，测 定光波长470nm；在多功能酶标仪上测定荧光度为A；

4)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中MUB的浓度S，S＝A*b；

5)根据MUB的量计算出酶活性；计算公式为：x＝[S*(30-50)]/(V*b*T)

式中：x为纤维素酶活性单位：μmol MUB·g^-1·h^-1，S为步骤4所获得的 荧光物质的浓度，V为反应体系内的溶液总体积单位ml，b为称取的土壤 重量单位：g，T为培养时间单位：h，所述MUB为4-羟甲基-7-香豆素。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述标准曲线的制 作及测定过程如下，①配制0.5mol·L^-1pH5.5醋酸缓冲液；②应用0.5 mol·L^-1pH5.5醋酸缓冲液配制浓度为0，0.01，0.05，0.1，0.25，和 1.0mol·L^-1MUB标准液，配制方法：称取MUB0，0.176，0.881，1.762，4.404 和17.62g定容至100ml，摇匀即可，此液需当日配制；③待土壤样品培养 结束后向微孔中加入100μl此系列溶液和100μl水，１00μl 2-2.5mol·L^-1NaOH 后进行荧光测定；此系列溶液中含有MUB0，0.1，0.5，1.0，2.5，10μmol； ④标准曲线每个点3-5次重复；⑤根据已知浓度的MUB量及通过荧光检测 数据得到工作标准曲线。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述微孔板为96微 孔板，使用96微孔板作为反应体系承载物，其应用使得大量土壤样品的同 时测定成为可能，提高检测效率。