[发明专利]采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种采用转化香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因ggpps提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)是侏罗纪的孑遗植物，基本保持了1.5亿年前的生态特征，因而成为一科一属一种的特殊植物，被达尔文称为“活化石”。银杏标准提取物是广泛用于治疗早期阿尔茨海默病、血管性痴呆等疾病的植物药。银杏叶提取物中具有药理作用和治疗效力成分主要为黄酮类和萜内酯类化合物，后者包括银杏内酯和白果内酯。目前从银杏中分离得到的二萜内酯有5个，即银杏内酯A、B、C、J、M。银杏内酯具有独特的二十碳骨架结构，嵌有一个叔丁基和六个五元环，包括一个螺[4，4]壬烷，一个四氢呋喃环和三个内酯环，是一类罕见的天然化合物，至今尚未发现存在于其他植物中。银杏内酯是在银杏中含量很低的一类组分，一般在千分之几左右，且提取分离手续复杂。白果内酯还有抗孢子原虫作用，能杀灭卡氏肺囊虫，但在银杏中的含量也很低。由于银杏萜内酯的分子立体结构复杂，人工合成途径的技术难度很大，因此，它们主要是从天然银杏植株中提取，但天然植物体内含量极其微少，使得银杏萜内酯来源困难。银杏中萜内酯的含量还受到植株发育阶段、细胞分区、组织分化和环境的影响，仅从天然植物中提取萜内酯远远不能满足市场需求。愈伤组织和细胞培养系统为生产这些有价值的萜内酯带来了希望。

经对现有技术的文献检索发现，国内外科学家尝试了采用各种方法，包括优化培养条件(Boonkaew，Boonkaew T.In vitro culture of Ginkgo biloba L.，PhDThesis，2001，UMI 3031078，ETH，Ann Arber，USA)、加入前体物质和使用化学或生物诱导子(戴均贵等.前体及真菌诱导子对银杏悬浮培养细胞产生银杏内酯B的影响.药学学报，2000，35：151-155)来提高银杏组织培养物中银杏内酯的含量。如Boonkaew对银杏组织培养的培养基条件进行了研究，比较了不同的激素配比和培养基类型，选择了MS培养基和1.0mg/Lα-萘乙酸和1.0mg/L激动素作为最优培养条件，发现使用0.8％植物凝胶作为凝结剂培养愈伤组织能提高根衍生愈伤中的叶绿素、银杏内酯和白果内酯，根衍生的愈伤组织比叶衍生的愈伤组织中的含量高，叶衍生愈伤中总银杏内酯的含量为25μg/g干重，根衍生愈伤中为34μg/g干重，而使用其他凝结剂如琼脂等几乎检测不到银杏内酯的存在。

虽然尝试了多种办法来提高银杏愈伤组织和细胞培养物中的萜内酯含量，但到目前为止，通过愈伤组织和细胞培养系统来产生萜内酯，其含量依然太低不具商业前景。代谢工程为改变植物细胞或愈伤组织的组成成份和增加植物细胞或愈伤组织萜内酯产量提供了一条诱人的方法。为了更有效地生产银杏萜内酯，开展银杏萜内酯生物合成途径及其催化酶基因的表达与调控研究，以及开展银杏萜内酯代谢工程研究将是提高银杏萜内酯含量并最终解决银杏萜内酯产品稀缺的有效方法。香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)是银杏萜内酯生物合成途径中的关键酶，是萜内酯代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，将所述的关键酶基因ggpps转化银杏，将打破萜内酯生物合成限速瓶颈，获得银杏萜内酯高产的银杏愈伤组织。目前尚未发现与本发明主题所提及的转化ggpps关键酶基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、萜内酯提取及含量测定、半定量RT-PCR分析用于本发明，建立了提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法，为银杏愈伤组织大规模工厂化生产奠定坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明从银杏中克隆ggpps基因，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ggpps基因导入银杏细胞并再生出愈伤组织；PCR和半定量RT-PCR检测外源目的基因ggpps的整合和表达情况，高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)银杏愈伤组织中萜内酯含量，筛选获得萜内酯含量显著提高的转基因银杏愈伤组织。

本发明包括如下具体步骤：

(1)采用基因克隆方法获得银杏关键酶基因ggpps；

(2)把ggpps基因可操作性地连于表达调控序列，形成含ggpps基因的植物表达载体；