[发明专利]一个与亚麻抗锈病基因相连锁的分子标记及其建立方法

说明书

技术领域：

本发明涉及分子标记的建立方法，尤其涉及与亚麻抗锈病基因相连锁的分子标记的建立方法。

背景技术：

亚麻(Linum usitatissimum L.)是重要的纤维和油料作物。亚麻的茎秆可以剥取高档纤维用于纺织业，籽粒可以榨制富含高不饱和脂肪酸的营养保健油品。随着人们生活水平的提高，发展亚麻生产显得越来越重要。长期以来亚麻生产受到许多病害的影响，其中由亚麻锈病菌(Melampsora liniEhrenb.Lev.)引起的锈病是世界性的亚麻病害。筛选和培育抗病品种是防治亚麻锈病最为经济、安全和有效的方法。

但是，目前抗锈病亚麻品种的选育都是依靠传统的育种方法，需要在田间进行锈病抗性的选择鉴定，周期长，工作量大。另外，抗锈病性状受遗传背景及环境因素影响较大，给依靠表型选择造成了困难。近几年发展起来的分子标记辅助育种技术，为植物育种学家提供了一条新的途径。该技术是将分子标记技术与传统育种学相结合，用稳定、可靠的DNA分子标记代替易受环境影响的表型标记，对育种材料进行筛选。利用分子标记辅助育种的关键是筛选到与目标基因紧密连锁的分子标记，因此，开发研究一个与亚麻抗锈病基因相连锁的分子标记的建立方法，以满足有关方面的需要，将具有十分重要的意义。

发明内容：

本发明需要解决的技术问题是公开一个与亚麻抗锈病基因相连锁的分子标记及其建立方法，以满足有关方面的需要。

本发明的技术构思是这样的：

本发明根据“群体分离分组法(bilked segregant analysis，BSA)”的原理，利用亚麻抗锈病材料与感锈病材料的杂交分离群体，通过RAPD技术开展亚麻抗锈病基因分子标记研究，寻找与亚麻抗锈病基因连锁的RAPD标记，以用于亚麻抗锈病的早期鉴定和针对该特性的分子标记辅助育种。

1、本发明所说的与亚麻抗锈病基因相连锁的分子标记，其特征在于，所述的分子标记OPA18₄₃₂，是用下述方法得到的：

(1)、按照潘家驹主编的《作物育种学总论》(中国农业出版社2003年出版)所叙述的亚麻杂交和自交方法，将上海市农业科学院园艺研究所保存的的亚麻高抗锈病的亲本NM4和高感锈病亲本Bison进行杂交，得到F1代，再经过自交获得F2分离群体。

(2)、用SDS方法(在本文的具体实施方式中有详细描述)提取F2代单株的DNA，并选取10株高抗锈病的单株DNA等量混合为抗病池(R池)，选取10株高感锈病的单株DNA混合为感病池(S池)；

(3)、利用两个亲本和两个基因池筛选引物，再利用获得的候选引物对F2代单株进行PCR扩增，验证多态片段的稳定性；

(4)、筛选出的分子标记OPA18₄₃₂，经过连锁性鉴定，与亚麻抗锈病基因相连锁。

2、与亚麻抗锈病基因相连锁的分子标记是采用RAPD分子标记进行筛选的，具体的方法是：

(1)、亲本间和基因池间DNA多态性分析：

采用上海生工生物工程有限公司合成的10bp寡核苷酸作为随机引物，在Mastercycler 5333型PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20μl，其中25mmol/L MgCl₂ 2.0μl，10×PCR Buffer 2.0μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，5U/μLTaq E 0.5μl，20ng/μl Primer 2.0μl，10ng/μl模板DNA3μl，灭菌双蒸水10μl，加盖一滴矿物油进行扩增。扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸1.5min，40个循环；72℃延伸10min后15℃保存。RAPD扩增产物电泳分析采用浓度为15g/L的琼脂糖凝胶(含0.15ng/LEB)，电泳缓冲液为1×TAE，保持90V恒压(4～5V/cm)电泳1.5～2h，凝胶成像仪成像分析。

(2)、分子标记的连锁性鉴定：

在同一条件下鉴定F₂代分离群体的锈病发生情况。用Mapmaker/3.0软件对分离群体单株的锈病抗性和分子标记的分离数据进行连锁分析，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距cM(centimorgan)。所说的Mapmaker/3.0软件在生物谷网站(http://www.bioon.com/Soft)可以下载。

本发明的与亚麻抗锈病基因相连锁的分子标记，可用于亚麻抗锈病的早期鉴定和针对该特性的分子标记辅助育种。