[发明专利]一种精氨酸脱酰酶共价修饰物、其制造方法及应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，提供了一种新的聚乙二醇共价修饰精氨酸脱酰酶(PEG-ADI)，发明还涉及该修饰蛋白的制造方法以及该修饰蛋白在治疗肝癌中的应用。

技术背景

肝癌是一种发病率高、治愈率低、死亡率高的消化系统肿瘤。我国肝癌的发病率为34/10万，约占全部肿瘤疾病的15-20％，是全球肝癌发病率最高的国家，目前有肝癌患者约50万人。我国每年有约10万人死于肝癌，约占全世界肝癌死亡人数的一半，恶性肿瘤死亡率中排名第2位。因此，肝癌治疗药物的研究关系到肝癌患者和全社会切身利益，一直是医药行业的研究热点，具有重要的社会意义。再者，我国每年用于肝癌治疗的费用超过10亿元人民币，因此开发肝癌治疗药物具有可观的经济前景。

从治疗手段上来说，肝癌细胞的治疗主要是外科治疗、放射、化疗、生物与综合治疗等。肝癌外科主要是肝癌切除、肝移植、局部栓塞治疗等。切除和栓塞的治疗方法适用于界限清楚、远离大血管的肿瘤，而且手术切除的预后差、五年存活率低。移植需要解决的主要问题在于免疫排斥反应，后者往往成为患者和社会重大的经济负担，成功率也只有50％左右，5年存活率也很低。放疗和化疗对正常细胞也有杀伤作用，其特点是专一性差、副作用巨大，在杀伤肿瘤细胞的同时也极大地干扰机体的正常功能，不利于长期用药。至今，FDA和欧洲药监部门没有批准一个专一用于肝癌治疗的药物。正由于肝癌缺乏有效控制方法，肝癌患者的预后极差。除可切除小型肝癌患者的5年存活率达到80～90％外，不能手术肝癌患者自症状发作后的平均存活时间只有3～4个月，而发展中国家全部肝癌病例的平均5年存活率仅为5％左右。因此，寻找肿瘤细胞特异性的药物是科学界始终关注的焦点。

研究表明，癌细胞多是精氨酸营养缺陷型，这些细胞不能合成精氨酸，必须依赖外界的精氨酸来维持细胞的生长繁殖；而人体正常细胞是能够自身合成精氨酸。这为肿瘤的治疗提供了一个重要的线索。降低循环血液中的精氨酸浓度，必将导致癌细胞营养缺乏，达到抑制癌细胞生长的作用。

支原体M.arginini是许多细胞培养的污染物微生物，它编码的一种酶-精氨酸脱酰酶(arginine deiminase，ADI)具有专一降解精氨酸的作用，在水的参与下能够把精氨酸分解为瓜氨酸和氨。ADI由arcA基因编码，蛋白总量占M.arginini可溶蛋白的10％。除了支原体M.arginini以外，其它许多微生物如Mycoplasma hominis、Mycoplasma arthritidis、Mycobacterium tuberculosis、Lymedisease spirochetes和Streptococcus等都编码ADI，后者催化精氨酸代谢，为生物体提供能量。M.arginini编码的ADI是由410个氨基酸组成的球型的生物大分子，分子量为46376.14，等电点为5.2，没有分子内二硫键，以二聚体形式出现。

近年来，ADI引起了人们极大的兴趣。据报道，ADI浓度在ng/ml的情况下可以抑制黑色素瘤、白血病、前列腺癌等细胞系的生长。除了能够减少特殊肿瘤细胞生长所必需的精氨酸以外，近几年的研究也认为这种酶参与细胞凋亡，并且具有抑制一氧化氮(NO)合成、中和肿瘤坏死因子等作用。此外，新近的研究显示ADI不但可以直接抑制癌细胞生长，而且可以抑制肿瘤新血管的生成。而肿瘤新血管的形成被认为是肿瘤生长的重要环节。

美国Phoenix Pharmacologics现在正在进行ADI修饰物治疗肝细胞癌的III期临床研究。日本Nippon Mining公司通过动物实验证明，ADI能够在体内、体外抑制6种肿瘤细胞系的生长，延长动物的生存时间。德国Essen的科研单位和医院联合试验，已经证明ADI抑制白血病细胞的生长比asparaginase更有效，也能抑制成神经细胞瘤。韩国汉城也在研究E.coli表达的ADI在抑制NO合成方面的调控作用。

众多基础和临床研究报告的结果证实了ADI的药理作用，据此可以乐观地期望ADI成为一个强有力的肿瘤治疗药物。

ADI直接作为药物有一些不利方面：由于ADI来源于微生物，应用于人会产生较强的抗原性；ADI半衰期仅为4小时左右，需要频繁用药以维持药效浓度。因而降低ADI的免疫原性、增强稳定性、降低血清清除率，延长半衰期就成为亟待解决的问题。

目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理：

1、增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率；