[发明专利]快速测定细胞角蛋白19(CK19)的方法和其引物及探针

说明书

发明领域

本发明涉及测定CK19mRNA，以及测定CK19和CK20mRNA的方法，尤其是在临床环境中。此外，提供了用于在实时基础上快速和特异性扩增以及检测CK19的mRNA的探针和PCR引物以及试剂盒。

发明背景

细胞角蛋白是一组形成细胞骨架的称作中间丝的蛋白质，且到目前为止，已经报道了至少20种亚种。那些细胞角蛋白主要地存在于上皮细胞中并且每个亚种的分布不同，这取决于上皮细胞的类型。

已报道细胞角蛋白19(CK19)在癌组织中比在正常组织中更丰富地表达，所述癌组织为如乳腺癌、胃癌、前列腺癌和肺癌，并且已研究了其应用到临床诊断中作为癌症诊断的临床标记以及也作为选择治疗策略的指标。例如，在早期乳腺癌中或者在早期胃癌中，存在使用CK19作为指标，通过诊断癌症是否转移到淋巴结，来判断外科手术期间减少淋巴结切割范围对于提高患者生活质量(QOL)的适当性的可能性。也有当使用CK19作为指标检查腹膜的洗涤物中存在或不存在癌细胞时，可评价患进行性胃癌患者腹膜接种(seeding)风险的可能性。

到目前为止，关于以高灵敏度检测基因的方法已经报道了LAMP方法、TRC方法、PCR方法等。

LAMP(环介导的等温扩增)法是一种使用四种引物和链上取代型DNA聚合酶在预定的温度有效地扩增目的基因的技术，其是针对将要扩增的基因区域中任何六个区域进行设计的(WO00/28082)。

TRC(转录反转录协同反应)法是一种在预定的温度扩增RNA的技术(EP0969101)，其中通过使用反转录酶的RNA酶活性和用于切割靶RNA的称作剪刀探针的DNA寡核苷酸修剪靶RNA以及通过重复反转录反应和转录反应扩增目的RNA区。在该技术中，RNA能够直接扩增，且因此在PCR和LAMP法中必需的反转录步骤不是必需的。

与PCR法相比，在那些用于核酸的扩增方法中扩增的步骤是复杂的，且另外，不可能同时扩增多个靶并且在一个反应管中检测它们中的每一个。这意味着不能在反应系统中结合用于区别假阴性和真阴性的内对照。因此，这种方法有如下问题，当应用到临床诊断时，可能不能区别假阴性样品，等等。

PCR法是一种具有良好重复性的可有效扩增任何DNA区域的技术，且目前，在医学、法医学、兽医科学、农业科学、药物科学、生物学等领域中从基础研究到实际工业，全世界广泛使用该技术。当将该技术与具有反转录活性的酶结合时，其也可能扩增任何mRNA区(RT-PCR)。也已报道了用于检测扩增产物的许多方法。当向PCR溶液中添加将荧光染料结合到DNA寡核苷酸中的荧光探针时，可实时进行扩增反应的监控(实时PCR)。也可能，当使用分别标记了多个荧光染料的荧光探针时，可在反应器中同时扩增多个靶DNAs(或RNAs)并且也可分别监控这种扩增反应的模式(多重实时PCR)。

尽管mRNA通过RT-PCR法的扩增是高度灵敏的，但是倘若在将要检测的样品中存在人DNA，即使仅存在少量，那么也扩增作为mRNA的计划的基因(DNA)。因此，可能难于判断扩增产物是来自RNA还是DNA。

在这种方法中有“假阳性”结果的某种可能性，其中将是阴性的结果判断为阳性。当这种方法应用到临床诊断时，这是个大问题。

作为避免这个问题的方法，在通过RT-PCR扩增RNA中进行这样的设计，从而使得内含子进入与这种RNA区域对应的基因的区域。

通常，基因被内含子隔开，所述内含子是不具有遗传信息的区域。因此，如果在通过RT-PCR扩增的区域中存在内含子，那么与mRNA的扩增产物相比，扩增DNA的PCR产物在内含子的程度上更大。在该情况中，即使当DNA污染了将要进行PCR的mRNA样品时，也可能可通过琼脂糖凝胶电泳等，其中可检测扩增产物大小的差异，来判断是mRNA被扩增还是DNA被扩增。

然而，当扩增没有内含子存在的基因区域时，扩增产物的大小与mRNA的情况完全相同。在这种情况中，不可能通过电泳进行判断。

当人基因(DNA)污染临床样品时，有存在加工型(process-type)假基因的另一个问题。假基因不作为基因发挥作用，且由于在加工型假基因的碱基序列中不存在内含子并且由于与mRNA的碱基序列有高度同源性，所以不可能通过扩增产物的大小进行判断。

已报道在CK19中存在加工型假基因。假基因与CK19mRNA的同源性至少90％。因此，如果发生假基因的扩增，那么与不具有内含子的基因区域的PCR的情况相比，有不能判断扩增产物是来自mRNA还是来自假基因的可能性。