[发明专利]树状结构标记物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗原/抗体免疫测试中使用的标记物及其制备方法，特别地，涉及用核酸和荧光分子的结合物对免疫检测进行多标记的方法。

技术背景

免疫分析方法由于具有高度的特异性、快速、简便等优势，已广泛的应用于生命科学，药物分析，临床诊断及环境监测领域。由于免疫反应自身产生的物理变化非常微弱，难于检测，通常在抗原或抗体上标记产生特异信号的物质或分子，称为标记物。根据产生信号的不同，标记物可分为放射性同位素、荧光染料、电化学分子、酶、化学发光物、电化学发光物等，其中荧光检测应用非常广泛，而且是生物芯片的标准检测方法。然而，随着对低丰度蛋白检测的需求日益迫切，进一步提高荧光免疫试验的灵敏度成为研究的热点。在免疫分析方法中，检测灵敏度的提高主要采取两种手段：一是体外扩增低丰度蛋白；一是增加信号分子的数量。前者在实际运用中难以实现，因为目前的技术条件难以使蛋白质像核酸(例如：DNA)那样，采用多聚酶链反应在体外扩增。因此，增加信号分子的数量就成为提高蛋白质检测灵敏度的主要突破口。在免疫分析过程中，信号分子通常是标记于抗体或抗原上，如何将更多的信号分子标记于同一个抗原或抗体上，使检测信号得到增强，同时不影响抗原或抗体的识别性能，是最大的难点之一。按照标记物和被标记蛋白之间联结方式的不同，标记方法可分为共价标记和非共价标记两类。而根据标记物与蛋白联结位点的数目，又可分为多个位点标记和单个位点标记。一般而言，共价标记的制备难度大于非共价标记，单个位点标记难于多个位点标记。其中单个位点多标记的蛋白标记方法由于在一个蛋白分子上引入了多个标记物，可大幅度地提高检测信号。同时由于在目标蛋白上只涉及单个联结位点，可最大限度地减少标记物对目标蛋白免疫活性的干扰，因此兼顾了免疫测试的信号强度和特异性。

采用核酸进行免疫测试标记，在专利和科研文章中已有描述或报道。在美国专利US4748111(公开日：1988-05-31)中，Dattagupta等人描述了一个用核酸作为信号分子载体对免疫测试进行多标记的方法，其中核酸的3’端与免疫测试的蛋白质通过共价键连接。在美国专利US4921788(公开日：1990-05-01)中，Deutsch描述了一个免疫测试分析物的单链核酸类似物，可是该类似物与抗体结合后，失去了与互补核酸的杂交能力，导致与核酸双链特异性结合的信号分子的信号下降。在美国专利US6280933(公开日：2001-08-28)中，Glazer等人描述了一个用双链核酸作为荧光分子载体对免疫测试进行多标记的方法，其中的荧光分子是核酸嵌入剂并带两个正电荷。在美国专利US6117631(公开日：2000-09-12)中，Nilsen描述了一个特定的树枝状核酸(DNA dendrimer)对免疫测试进行多标记的方法。另外，在美国专利US5665539(公开日：1997-09-09)中，Sano等描述了一个称为免疫PCR(immuno-PCR)的方法，用核酸对免疫测试进行标记，然后通过PCR对核酸标记进行扩增，最后通过核酸定量进行免疫分析。国内目前还没有这方面的专利。

发明内容

本发明主要是针对现有技术以下几个方面的不足进行改进：1)为了降低在抗体上标记信号分子的难度，采用非共价的方式引入信号分子载体；2)为了实现单个位点多标记的策略，以核酸为信号分子载体；3)为了获得简便且适应范围更广的信号分子标记方法，采用非嵌入式核酸结合剂。简言之，即是以核酸为信号分子载体，通过核酸的多个作用位点引入大量的荧光信号分子，搭建一种由核酸/荧光分子结合体构成的链状标记物，用于免疫检测。与常规的免疫荧光测试比较，本方法提供的标记物中的荧光信号分子不只一个，而是多个甚至几十个，因此可以大幅度提高检测信号的强度，明显改善检测灵敏度。与通过化学合成方法制备的有机聚合物、树枝状有机分子(dendrimer)、无机复合物和无机纳米标记物比较，本方法采用常规生化和化学试剂，易于获得，价格低廉，操作简单，重复性好。

本发明的一个方面提供了一种树状结构标记物，其包含核酸，荧光分子，和蛋白质/化合物，其中所述的荧光分子与作为载体的核酸通过非嵌入方式结合形成信号标记物，所述信号标记物与蛋白质或化合物以非共价键方式连接，形成树状结构。

本发明的第二个方面提供了所述树状结构标记物的制备方法，其包括下列步骤：

(a)提供核酸作为荧光分子的载体；

(b)以非嵌入方式将多个荧光分子与所述核酸结合，形成高结合率的结合物；和