[发明专利]一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1－CpG－Loop

说明书

技术领域：

本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种用于预防犬传染性肝炎的DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop

背景技术：

犬传染性肝炎是由犬腺病毒一型(Canine adenovirus-1，CAV-1)引起的急性败血性疾病，目前预防以灭活苗和减毒苗为主。DNA疫苗，是近年兴起的新型疫苗，具有抗体效价维持时间长和交叉保护效果好等优点。此外DNA疫苗还具有以下突出优点：(1)能诱发体液及细胞全方位免疫应答，起到预防作用；(2)免疫保护时间长；(3)生产工艺简单、成本低廉、稳定性好且贮运方便。

发明内容：

本发明提供一种预防犬传染性肝炎的DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，可用于预防犬传染性肝炎的感染。其作用机理为：将犬腺病毒一型抗原基因Loop插入真核表达载体，将其注射于肌肉组织，使其在肌细胞中表达病毒抗原，经过抗原提呈过程，可激活体内的体液免疫系统和细胞免疫系统。激活的体液免疫系统可产生特异的抗体，消除游离在血液中的病毒，预防犬肝炎病毒的入侵；

犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)，属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属成员，各类腺病毒具有相同的结构，外形是无包膜的球形结构，衣壳为二十面体立体对称，由252个壳粒组成，其中240个非顶角壳粒为六邻体(hexon)，为主要的包膜蛋白；12个顶角的壳粒称为五邻体(penton)；还有三聚体蛋白的纤维。其中五邻体基底一端通过非共价键与三聚体纤维相连，另一端吸附到细胞膜上。目前，已对六邻体蛋白的结构和功能进行了广泛的研究。每个六邻体是六邻体蛋白的同源三聚体，是大于900个残基的复杂蛋白。三聚体的六邻体分子有一个五面体的基底和三角形的塔尖，基底包含两个区域P1、P2区，塔区由4个环构成即Loop1、Loop2、Loop3、Loop4。Loop1是最长、最复杂的环，自身折叠许多倍，与周围环境相互作用。通过一组单克隆抗体来检测不同型的纯化的六邻体蛋白表明，在六邻体表面有许多的抗原决定簇在这几个环上。对15个不同型的腺病毒的六邻体蛋白的序列研究表明，基底区P1、P2是保守的，变化区主要集中在Loop1、Loop2上。Loop1、Loop2存在有7个独特的超变区(Hypervariable Region，HVR)，在这7个HVRs中，HVR1-HVR6出现在Loop1中，HVR7出现在Loop2的塔尖。其中HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7中都含有中和抗原决定簇，而且抗原决定簇至少包括两个或两个以上的HVRs。目前证实六邻体蛋白可以引发极强的中和反应，中和抗原决定簇主要存在六邻体上，而六邻体中主要抗原决定簇集中在Loop1区和Loop2区。本发明根据GeneBank中犬腺病毒I型和人腺病毒2型的六邻体蛋白基因序列及氨基酸序列，设计并合成了Loop1和Loop2基因，连接两个基因命名为Loop，将Loop克隆到质粒载体pVAX1-CpG，构建疫苗pVAX1-CpG-Loop；

合成的Loop蛋白核苷酸序列为：

Loop1

AACTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTAACACTTTAGCCCAAGTGCCATTTGCGGGCGCCATT

ACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGCTGGGCCCTGAAAGT

TGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAGCATCGACCCCACGC

ATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAACTGGGGCCGTGGAA

CGAAGATTCTATAAAGTGACCACCAACAATAATAATGAAGCTGATGCCCTACTATATACAGAAGATGTG

AACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTACAGGTGTACAGGGA

CTGGGGCAACAA

Loop2

AACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGGGACCATTAACTAACATGACAGCTATGAAGGTCAATAATCAA

AACTTTCAAACGGACAACACTAACGTGGGTCCCATTCAAAAGATTGGTTTCGGAAATGTTGAGGCCATG