[发明专利]一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1－CpG－Loop

权利要求书

1.一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，其特征在于由犬腺病毒六邻体蛋白中和抗原决定簇改造后的编码基因和真核表达载体构成，改造后的Loop蛋白编码基因的核苷酸序列如下：

CGGGATCCATGAACTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTAACACTTTAGCCCAAGTGCCATTTGC

GGGCGCCATTACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGCTGGGC

CCTGAAAGTTGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAGCATCGA  

CCCCACGCATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAACTGGGGC

CGTGGAACGAAGATTCTATAAAGTGACCACCAACAATAATAATGAAGCTGATGCCCTACTATATACAGAA

GATGTGAACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTACAGGTGTAC

AGGGACTGGGGCAACAACCCGGGTCCCCCGGGAACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGGGACCATTAAC

TAACATGACAGCTATGAAGGTCAATAATCAAAACTTTCAAACGGACAACACTAACGTGGGTCCCATTCAA

AAGATTGGTTTCGGAAATGTTGAGGCCATGGAGATAAATCTCAATGCTAACCTCTTTAAAGGTTTTCTCT

ACTCCAATGTGGCCCTATACCTACCTGATGCCTATAAATACACACCTGATAACATTGTAGCTCCTGCTAA

TGCAAATACCTATGCTTACATGAATGTGAGATTGCCCGCTGCTAACCTTATAGACACATTTGTAAATATT

GGCGCCAGATGGTCACCTGATGTAATGGACTCTGTTAATCCTTTTAACCACCACAGAAATGCAGGACTCC

GCTACCGATCACAGCTGCTTGGCAATGGCCGCCTCGAG。

2.按权利要求1所述的犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，其特征在于所说的真核表达载体为pVAX1-CpG。

3.按权利要求1所述的犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，其特征在于所说的疫苗制备方法

①构建pVAX1-CpG-Loop重组质粒：

用限制性内切酶BamHI和Xho I对Loop基因DNA进行双酶切。反应体系为：Loop基因DNA 5μl(200ng/μl)；10×M Buffer是由pH7.5 100mM-150mM Tris-HCl；100mM MgCl₂；1mM-10mM二硫苏糖醇；100mM NaCl组成；BamHI酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；补H₂O至总体积20μl。37℃温浴消化2小时。之后将消化样品进行1-2％低溶点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收Loop酶切片段。同时，用BamHI和Xho I双酶切pVAX1-CpG载体。反应体系为：pVAX1-CpG载体2μl(200ng/μl)；10×M Buffer 2μl；10U/μl的BamH I酶1μl；12U/μl的Xho I酶1μl；补H₂O至总体积20μl。37℃温育消化2小时。之后将消化样品进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pVAX1-CpG酶切片段；

将上述pVAX1-CpG酶切片段与Loop酶切片段混合，以连接酶进行连接。连接反应体系为：pVAX1-CpG酶切片段0.5μl(200ng/μl)；Loop酶切片段1μl(50ng/μl)；由600mM-660mM Tris-HCl pH7.6；60mM-66mM MgCl₂；100mM二硫苏糖醇；1mM ATP组成的连接Buffe 1μl；补H₂O至总体积10μl。连接反应的条件定为12℃10小时；连接反应得到连接产物；

②构建pVAX1-CpG-Loop工程菌：

将上述连接产物以CaCl₂法转化至感受态大肠杆菌DH5α中，操作如下：连接产物10μl与1～2×10⁹细菌/ml的DH5α和感受态细胞200μl混合，冰浴放置30分钟，42℃2分钟，冰浴10分钟，加入0.6ml由18g蛋白胨/L；10g酵母抽提物/L；5g NaCl/L组成的2YT液体培养基，37℃培养45分钟后铺于含卡那霉素的琼脂平板。37℃培养12小时后在琼脂平板上出现转化子。挑选转化子接种在含100μg/ml卡那霉素的3ml 2YT培养基中37℃培养过夜，6，000rpm/分钟离心收集菌体，以质粒小量抽提试剂盒(Qiagen)提取重组质粒DNA。然后用HindIII和Xho I双酶切鉴定。反应体系为：重组质粒1μl(200ng/μl)；10×M Buffer 2μl；HindIII酶(10U/μl)1μl；XhoI酶(12U/μl)1μl；补H₂O至总体积20μl。37℃温育消化2小时。之后将消化样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果可见860bp的Loop片段和2.99kb的pVAX1-CpG载体片段。说明筛选到的该阳性转化子为重组pVAX1-CpG-Loop的工程菌；

③犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop的制备

本发明的DNA疫苗是用上述重组工程菌株制备的。培养方式为液体培养。采用细菌培养。选用2×YT培养基含1.6-2％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5-1％氯化钠，pH7.0。培养温度为37℃，培养时间为24小时；

从扩增后的工程菌中分离纯化质粒DNA，采用常规方法具体步骤如下：

100g湿菌中加入800mL溶液I含50-60mM葡萄糖，25-30mM Tris-Cl pH8.0，10mM EDTA强烈振荡混匀。加入新鲜配制的1L溶液II含0.2N NaOH，1％SDS垂直轻柔混匀，室温5分钟。再加入冰预冷的0.75L溶液III含1M醋酸钾，7M醋酸铵pH4.8垂直轻柔混匀，冰浴5分钟。连续流12000转/分钟4℃离心取上清。在上清中加入1.53L异丙醇室温10分钟，连续流12000转/分钟室温离心留沉淀。加70％乙醇450ml漂洗过夜。10000转/分钟4℃离心10分钟留沉淀。加1LpH7.4的PBS溶解，加终浓度0.1％RnaseA 65℃消化30分钟。再加入等体积的PEG溶液：含PEG8000 13％，氯化钠1.6M，沉淀；12 000转/分钟4℃离心10分钟，留沉淀。200ml PBS溶解沉淀，加1％体积曲拉通X114混匀，冰浴5-10分钟，37℃30分钟，37℃12 000转/分钟离心10分钟，取上层水相。最后用0.45μm和0.22μm双层滤膜加压过滤，用PBS缓冲液稀释至1mg/ml，即得犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop。