[发明专利]精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物化学领域，具体涉及一种活性肽类物质精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法。

背景技术

细胞外基质及基底膜中的纤维连接蛋白(Fn)、玻璃体连接蛋白(VN)、胶原蛋白(Collagen)、血管性假血友病因子(vWF)等均含有一高度保守的氨基酸序列-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列。美国癌症研究中心的Pierschbacherherhe和Puoslahti于1984年首次发现并鉴定了此三肽的细胞粘附作用。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是整联蛋白的主要识别位点，而整联蛋白又是一类在细胞信号转导中发挥重要作用的细胞粘着因子。所以此三肽序列可以模拟细胞外基质成分被整联蛋白所识别从而对细胞进行调节。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列在生物体内的功能很多。层粘连蛋白出现于早期胚中，对于保持细胞间粘连，细胞的极性及细胞的分化都有重要意义。层粘连蛋白也与肿瘤细胞的转移有关。而层粘连蛋白正是通过此三肽序列与细胞膜上的整联蛋白结合，从而在胚胎发育及组织分化中发挥重要作用。

在细胞外基质中的纤连蛋白中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是其被细胞识别的最小结构单位。其受体也为整联蛋白家族成员之一。纤连蛋白的功能主要是介导细胞粘着。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织促进细胞铺展。在胚胎发育过程中，纤连蛋白对于许多类型的细胞迁移和分化是必需的。在创伤修复中，纤连蛋白促进巨噬细胞和其他免疫细胞迁移到受损部位。在血凝块形成过程中，纤连蛋白促进血小板附着于血管受损部位。显微注射纤连蛋白受体的抗体或含此三肽序列的短肽可以阻断细胞的迁移。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列与肿瘤细胞及其新生内皮血管表面的整联蛋白受体结合，参与肿瘤细胞的浸润过程。粘附是癌细胞侵袭的始动步骤。肿瘤细胞通过膜表面受体粘附于基底膜及细胞外基质成分。肿瘤细胞与细胞外基质的多种成分(如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等)的相互粘着，是肿瘤转移过程的重要环节，此类肽限制了肿瘤细胞向细胞外基质的粘附及转移。人工合成此肽类的氨基酸序列，竞争性地与肿瘤细胞表面的整联蛋白受体结合，抑制细胞与基质之间的粘附，达到抑制肿瘤细胞浸润、转移的目的。近年来，还发现此三肽在伤口愈合、神经再生、皮肤修复等方面具有良好的作用。

综上所述，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是多种生物细胞外基质和血浆蛋白结构中常见的基本成分，也是广泛存在于细胞间识别系统的基本单位，能与细胞表面整联蛋白特异性结合，从而介导许多重要的生命活动。外源性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽能与体内含此三肽序列的物质竞争结合整联蛋白，从而具有一系列生物学功能。近些年的研究发现，和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列相连的第4位的氨基酸对其活性影响较大，和此三肽序列相连的第5位氨基酸对肽的结合专一性也起到重要的作用。含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(简写为精-甘-天)序列并具有生理功能的四肽有精-甘-天-丝氨酸、精-甘-天-缬氨酸、精-甘-天-苏氨酸、精-甘-天-胱氨酸、精-甘-天-苯丙氨酸等。

精-甘-天-丝氨酸四肽由于含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列，可以占领血小板表面的GP IIb/IIIa受体，因此可以抑制纤维蛋白参与的血小板聚集和血栓形成。

精-甘-天-丝氨酸四肽能抑制结肠癌细胞骨肉瘤细胞与血小板的粘附。如静注后此四肽可干扰肿瘤血管生成，使肿瘤灶生长缓慢。作用机理为阻断了血管内皮细胞表面整合素αVβ3与细胞外基质(ECM)的联系，使血管内皮细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长和转移。

精-甘-天-丝氨酸四肽是血小板膜上GPIIb/IIIa受体的拮抗剂，具有对血栓部位活化血小板的趋向性，能与血小板Fg片断特异性结合，用精-甘-天-丝氨酸四肽修饰成尿激酶脂质体(第一代靶向脂质体，即导向弹头直接连在脂质体表面)，可望作为血栓靶向制剂的导向弹头。此四肽还能明显促进成骨细胞的生长，对成型骨强度有一定的影响。

由于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA(AA代表N端游离的氨基酸或其衍生物)四肽具有如此广泛的作用，吸引了很多人对其功能进行研究，希望它能为多种疾病的治疗提供新方法。然而精-甘-天-丝氨酸四肽的价格十分昂贵，不但限制了它的应用，而且也制约了对它的应用的深入研究。

对于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽的合成已经分别有了酶法合成、化学法合成、化学法与酶法相结合的方法来合成。而我们选择了化学法合成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA四肽，并提出了合成此类四肽的规律性认识与创新性方法。