[发明专利]重组古菌组蛋白HPhA作为基因药物载体及在制备抗癌药物方面的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来自超嗜热古菌Pyrococcushorikoshii的重组古菌组蛋白HPhA作为基因药物载体的应用，以及HPhA与质粒pCMV-p53(wt)形成的基因药物载体复合物在用于制备抗癌药物方面的应用。

技术背景

基因治疗(gene therapy)就是用外源正常基因校正或置换致病基因的一种治疗方法，目前基因治疗的对象主要是肿瘤。恶性肿瘤发病率高，缺乏有效的治疗手段，传统治疗方法治愈率低、复发率和死亡率高、治疗效果差。人们对肿瘤治疗除采用传统手段之外，尝试从基因水平上对其进行根治。

抑癌基因正常功能的丧失是肿瘤发生的重要环节之一，p53基因是目前发现的人类肿瘤中基因改变频率最高的抑癌基因，通过恢复肿瘤抑制基因p53的功能以治疗肿瘤的p53基因治疗已被广泛应用于鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌神经胶质瘤等肿瘤疾病的研究中，是近年来医学研究的热点。

载体系统是基因治疗成功的关键技术之一，特别是分子生物学的快速进展，人类基因组计划的初步成功，可供选择的治疗基因很多，但是载体系统的发展却相对滞后。载体系统分为病毒和非病毒载体，各有利弊，基因治疗的方案中病毒载体还是占了巨大部分。

随着近来对生物安全性的要求提高，以及病毒载体基因治疗发生的事故，使得非病毒载体的关注日益提高。目前已有的非病毒载体介导基因转染方法有：裸DNA注射转染、磷酸钙介导转染、电转移法转染、阳离子脂质体转染及阳离子聚合物转染等。

非病毒载体虽然没有病毒载体的缺点，但转染效率都不如人意。阳离子脂质体转染效率较高、重复性好、但其对细胞的形态及活力均有很强毒副作用。显微镜观察发现使用Lipofectin或Lipofectmanine非病毒载体，可引起细胞形态学改变，细胞破裂及降低细胞活力，使其应用受到很大限制。因此进一步开发安全，有效且有优良特性的非病毒载体系统是发展基因治疗的当务之急。组蛋白载体的出现有可能突破这一瓶颈，使基因治疗成为临床治疗手段。

发明内容

本发明的目的之一，是将来源于超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii的重组古菌组蛋白HPhA用作基因药物载体方面的应用。

本发明的目的之二，是利用重组古菌组蛋白HPhA与pCMV-p53质粒构建HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物。

本发明的目的之三，是上述基因药物载体复合物在用于制备治疗鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌神经胶质瘤等恶性肿瘤药物方面的应用，从而弥补背景技术中所述药物载体在基因药物治疗方面的缺陷。

本实验室的前期工作制备了重组古菌组蛋白HPhA(参见Weng L.Feng Y，JiX，et al.Recombinant expression and characterization of an extremelyhyperthermophilic archaeal histone from Pyrococcus horikoshii OT3，Protein ExprPurif，2004，33：145-152)，在该文章中详细给出了该重组古菌组蛋白HPhA的制备过程，基因序列及该蛋白的性质。该重组古菌组蛋白HPhA的基因来源于超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3，日本学者于1998年报道了Pyrococcushorikoshii OT3的全基因组序列，并在它的全基因组序列中预测有古菌组蛋白的开放阅读框PHS051和PHS046，编码两种古菌组蛋白。本实验室钓取超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3中的PHS051基因(Gen-Bank Accession No.AP000007)，参照古菌组蛋白基因序列和大肠杆菌偏爱密码子表，采用PCR定点突变技术，得到组蛋白基因，克隆到表达载体pET11A，转入大肠杆菌BL21-Codon Plus^TM(DE3)-RIL中，经表达、纯化，得到重组古菌组蛋白—HPhA。

HPhA与真核组蛋白在氨基酸的序列上十分相似，但比真核组蛋白要小(真核组蛋白100-140aa，而古细菌组蛋白60aa)，它保留了真核组蛋白的核心结构。HPhA分子既保持了真核生物组蛋白的基本二级及三级结构，而且其分子量小(70aa)、稳定性好、DNA结合及组装(Compact)能力强，因此能够成为比真核生物组蛋白更好的基因药物载体。