[发明专利]以无血培养基制备A群链球菌制剂的方法及无血培养基

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵工程领域，涉及一种利用无血培养基代替血培养基制备A群链球菌制剂的方法，特别涉及一种以无血培养基制备A群链球菌制剂的方法及无血培养基。

背景技术

A群链球菌制剂又称OK-432，属于生物治疗药物，是A群链球菌弱毒株经培养、扩增、青霉素处理后制成的冻干品，已应用于临床治疗，如癌性胸腹水及恶性肿瘤的免疫治疗等，其性能稳定且抗癌疗效显著。但由于传统制备工艺中常用含血及血浆培养基，使该制剂成本相对较高，并且容易带入异源性物质，增加热源物质含量，注射给药易引起患者的过敏反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种以无血培养基制备A群链球菌制剂的方法。

本发明的另一目的是提供一种无血培养基。

以无血培养基制备A群链球菌制剂的方法如下：

该方法包括以下步骤：

(1)、无血培养基的准备：对无血培养基在4500r/min的条件下离心30min、抽滤，以保证培养基澄清无杂质，然后灭菌待用；

(2)、传代：在无菌室内开启A群链球菌弱毒株工作种子批，在斜面培养基上在37℃的条件下，培养20小时传三代，然后分别接种在无血培养基，在37℃、120r/min的条件下振荡培养20小时制备种子液，在传代前要进行革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌则废弃；

(3)、制备A群链球菌制剂；将制好的生产用种子液接种在无血培养基中，在37℃、140r/min的条件下振荡培养20小时，在接种前要进行革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌则废弃；

(4)、菌体灭活：将青霉素和过氧化氢加入培养物内灭活，经过振荡、45℃水浴30min，4500r/min离心30min；

(5)、产品收集：经过菌体灭活后的培养物用生理盐水悬浮，二次离心后将沉淀物在-37℃冻干72小时得到白色菌体干粉制剂即A群链球菌制剂，称重后密封保存于无菌瓶中。其中的青霉素由华北制药集团有限公司生产制造；所使用的A群链球菌为A群链球菌ATCC19615，由吉林省疾病防止控制中心提供；A群链球菌弱毒株工作种子批由吉林大学生命科学技术研究所提供。

上述步骤中：

灭菌所用的设备为YXQ-SG41-280高压灭菌锅，由上海医用核子仪器厂生产制造；

离心所用的设备为RC-3BPLUS低速大容量冷冻离心机，由美国Du Pont公司生产制造。

振荡所用的设备为HZQ-Q全温振荡器，由哈尔滨东联电子技术开发有限公司生产制造；

水浴所用的设备为DK-89-I电子恒温水浴锅，由天津市斯泰特一起有限公司生产制造；

冻干所用的设备为Lyolab3000冷冻干燥机，由丹麦生产制造；

镜检所用的设备为HK光电显微镜，由台湾OLYMPUS公司生产制造。

无血培养基

无血培养基的优化：

重点考察培养基氮源、碳源和能源对菌体生物产量的影响，选择胰蛋白胨、葡萄糖和酵母粉含量为考察因素，以生物产量为试验指标，设计均匀实验，实验结果进行偏最小二乘回归建模确定最佳配比。

经过回归分析可得出最佳培养基重量配比为：胰蛋白胨1.2％、葡萄糖0.9％、酵母粉0.4％、氯化钠0.5％、磷酸二氢钾0.5％、其余为水；pH值为7.4～7.6。其中的胰蛋白胨及酵母粉由英国OXID公司生产制造。试验设计及结果如表1所示。

表1优化实验设计及结果