[发明专利]特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR引物及方法

说明书

技术领域

本发明属病毒鉴别领域，尤其是涉及一种特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR引物。

背景技术

新城疫病毒属于副粘病毒科，引起鸡的急性传染病，该病对养鸡业危害巨大。根据新城疫病毒的毒力差异可将其分为强毒型、中毒型、弱毒型3种类型，其中强毒型、中毒型新城疫病毒可引起鸡新城疫病症，因此，建立快速检测强、中毒力型新城疫病毒的方法就显得十分重要。聚合酶链式反应(PCR)技术是快速检测病毒的最有效的方法之一，但目前采用PCR技术检测鸡新城疫病毒时，所设计合成的引物为通用性的，对各种毒力的新城疫病毒都呈现阳性结果，不能区分强、中、弱毒型。此外，传统PCR技术在热循环反应结束后还需要进行电泳来进行结果判定，相对比较繁琐，且采用肉眼观察的方法其敏感度相对不是很高。

发明内容

鉴于区别强、中毒力型新城疫病毒在疫病防治方面的特定实际意义，本发明的目的是根据不同毒力新城疫病毒F基因核苷酸序列组成的不同，设计并合成了一对能专门检测强毒型及中毒型鸡新城疫病毒的引物，旨在用于特异检测强毒型及中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR技术中，并使之具有较好的使用便利性和良好的敏感性。

检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的特异引物的核苷酸链序列如下，分别为上游引物和下游引物：

SEQ ID NO：1 5′-GTGAATTCTTGATGGCAGGCCTCTTGC-3′

SEQ ID NO：2 5′-GCTTATTGCTACACTGCCG-3′

采用所示序列引物进行荧光定量PCR，只有强毒型和中毒型病毒株呈现阳性，而弱毒型病毒株为阴性。

PCR反应模板制备：从待测样本提取RNA并反转录合成cDNA作为模板。PCR反应：采用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的引物；PCR反应体系为25μl时，在PCR管中依次加入SYBR^Premix Ex Taq^TM 12.5μl，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列引物(浓度为10μM)各0.5μl，去离子水10.5μl，最后加入模板到25μl，混合后在荧光定量PCR仪上进行热循环，其条件为：95℃变性3min；然后进行共40个94℃30s，58℃30s，72℃40s的循环，反应结束后进行溶解曲线分析；在无模板对照和空白对照没有出现扩增曲线的条件下，凡出现扩增曲线且熔解温度为86±1.0℃的均为阳性结果，不出现扩增曲线的为阴性结果。

用24株已知病毒类型的样本进行检测，采用所述引物进行SYBRGreen I模式的荧光定量PCR，结果显示，本发明所设计的引物只对鸡新城疫病毒强毒型及中毒型病毒株有阳性扩增，而对该病毒弱毒株及其他非新城疫病毒来源的核酸没有扩增曲线，呈现阴性，最后结果如图1所示。

综上所述，本发明根据不同毒力新城疫病毒F基因核苷酸序列组成的不同，设计并合成了一对能专门检测强毒型及中毒型鸡新城疫病毒的引物，可以在鸡新城疫病毒的荧光定量PCR技术中提供对强毒型及中毒型病毒株的特异性检测。实施例2敏感性实验结果证明了引物和方法的良好敏感性。实施例3对两只疑似NDV强毒株感染的鸡只进行检测并经核苷酸测序验证实验，证实了本发明引物和方法明显的特异性。这样可以对引起鸡新城疫病症的强毒型和中毒型新城疫病毒进行有效辨识，有利于快速防治措施的施行。

附图说明

图1为采用本发明的引物及方法对已知病毒类型的样本进行SYBR Green I模式的荧光定量的PCR扩增曲线图，其中，扩增曲线高于基线者为阳性；而低于基线者为阴性。

图2为图1之判断结果列表。

图3为本发明与常规血凝试验定量检测敏感度比较结果列表。

图4为本发明实施例3荧光定量PCR的扩增曲线图。

具体实施方式

实施例1：引物的特异性试验