[发明专利]一种DNA的荧光检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种DNA的荧光检测方法及其试剂盒。

背景技术

基因(DNA或RNA)是遗传信息的载体，在生物的个体生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命过程中起着极为重要的作用。基因检测在临床诊断、单核苷酸多态性分析、基因测序、环境分析、反控等领域具有重要的意义。随着人们对自身健康的日益关注，对肿瘤、癌症等重大疾病早期诊断技术的要求也越来越高，因此迫切需要发展高灵敏度的基因检测技术。基因突变是单核苷酸多态性的形式之一，与多种疾病的发生有着密切的关系，最新研究表明，有四百多种疾病的发生与基因突变有关。为了在发病早期就能检测到极微量致病基因的存在，常常需要对待测基因进行PCR扩增或采用其它形式的信号放大方法，如纳米金放大、共轭高分子放大、酶联放大等(L.Pang，J.Li，J.Jiang，G.Shen，R.Yu，Anal. Biochem.2006，358，99；D.Q.Tang，D.J.Zhang，D.Y.Tang，H.Ai，J.Immunol.Methods 2006，316，144；X.Yao，X.Li，F.Toledo，C.Zurita-Lopez，M.Gutova，J.Momand，F.Zhou，Anal.Biochem.2006，354，220)。

本申请人公开号为CN1808101A的专利申请中公开了一种DNA的荧光检测方法及其试剂盒，该检测方法包括：利用连接于磁性颗粒上的捕获探针将待检DNA从生物样品中进行磁性富集和分离；然后加入荧光基团(FAM)标记的信号探针，使磁性分离和富集后的待检DNA与信号探针杂交配对，并用低盐缓冲液洗涤；再加入水溶性导电高分子材料，即共轭高分子(如聚芴衍生物PF)实现信号倍增，用该导电高分子材料的激发波长作荧光光谱，利用荧光共振能量转移(FRET)检测方法检测分析出待检DNA。该方法具有较高的特异度和敏感度。但是，一方面低盐洗涤的过程会增加操作的步骤，延长反应和检测时间；另一方面，低盐溶液也会使完全互补的双链DNA部分解链，从而使互补与突变的可区分性减小，即会降低对突变的选择性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种选择性更佳的DNA的荧光检测方法，而且该方法灵敏度高，无需扩增，操作快速简便，综合性能高。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种采用上述DNA的检测方法的试剂盒。

本发明人在上述CN1808101A公开的技术方案基础上，经过进一步的研究，发现采用竞争机制，磁性颗粒对靶向DNA的富集、分离，以及水溶性共轭高分子与荧光基团之间的FRET技术相结合，可以大大提高DNA检测的特异度和灵敏度，缩短了反应时间，综合性能更佳，特别可用于基因及突变基因的检测，更有希望应用于一些与基因突变有关的病症，如肿瘤的诊断。其中，竞争机制是生物检测中经常采用的一种用于提高选择性的检测方法，如ELISA竞争法和竞争性PCR等。在基因(DNA)检测中，也常采用这种方法。与线性DNA分子相比，茎环结构DNA探针由于可以形成特定的茎环结构，与其互补的靶向DNA结合时具有更窄的融解温度范围和更高的选择性(G.Bonnet，S.Tyagi，A.Libchaber，F.Kramer，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，96，6171)，常用于单碱基错配的检测。因此，茎环结构竞争探针的引入将会进一步提高DNA生物传感器的综合性能。

因此，本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案是：一种DNA的荧光检测方法，包括以下步骤：

1)将捕获探针连接在磁性颗粒表面；

2)加入待测的靶向DNA和荧光素修饰的信号探针，该捕获探针能与靶向DNA的一段核苷酸序列杂交，该信号探针能与靶向DNA的另一段核苷酸序列杂交，通过DNA之间的杂交，形成磁性颗粒-靶向DNA-荧光素修饰的信号探针的三明治夹心结构；

3)最后除去游离的荧光素修饰的信号探针后，加入具有信号倍增功能的水溶性的共轭高分子，对该信号探针上的荧光信号进行放大检测，从而检测出靶向DNA；

其中，步骤2)在杂交时还加入上述捕获探针或信号探针的竞争性探针，与靶向DNA竞争结合。

优选的，所述的捕获探针可以是茎环结构的DNA探针，同时所述的信号探针是线性DNA探针，所述的竞争性探针无任何修饰，其序列组成与捕获探针仅相差一个碱基。

优选的，所述的捕获探针可以是线性DNA探针，同时所述的信号探针是茎环结构的DNA探针，所述的竞争性探针无任何修饰，其序列组成与信号探针仅相差一个碱基。