[发明专利]从微生物发酵液中分离提取透明质酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及透明质酸的制备方法，尤其涉及从微生物发酵液中分离提取透明质酸的方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖通过β，1-3和β，1-4糖苷键所构成的重复单元而形成的线性高分子粘多糖，双糖单位数为300-1100对，分子量范围10⁵-10⁷Da。

1934年，Meyer和Palmer从牛眼玻璃体中分离出一种大分子多糖，他们把这种多糖命名为透明质酸。HA溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有机溶剂。由于其溶液具有超强的持水性、粘弹性和生物易吸收性，被广泛由于眼科手术、腹腔手术中预防粘连、关节炎以及化妆品等领域。

透明质酸的生产主要有动物组织提取法和发酵法两种生产工艺。在早期主要是提取法，可用于生产透明质酸的动物器官组织主要有鸡冠、人脐带和动物眼球。由于受原料来源少以及透明质酸含量低的限制，提取法生产透明质酸成本较高。与提取法相比，发酵法生产规模不受原料来源限制，发酵液中透明质酸以游离状态存在，易于分离纯化和形成规模化工业生产，所以生产成本远低于提取法，而且无动物来源的致病病毒污染的危险，且可以得到大分子量、高产量的HA。因此，目前提取法正逐渐被发酵法取代。

已知的使用微生物分离并纯化透明质酸的方法如下：美国专利No.4784990描述的纯化方法包括：向兽疫链球菌的培养液中加入乙醇使透明质酸从微生物中分离出来，然后用氯代十六烷基吡啶使其沉淀。HA得率仅60-70％，需要经高温加热、两次过滤、二次络合、四次醇沉及一次过柱才能制得高纯度HA。美国专利No.5316926描述的纯化方法包括：向发酵液中加入0.01％的硫酸月桂酯(SLS)表面活性剂以分离附着在细胞壁上的透明质酸，然后加入阳离子表面活性剂氯代十六烷基吡啶以形成透明质酸沉淀，并用醇使其沉淀。该过程也另外包括三次过滤和四次醇沉，还需之前对荚膜用SLS处理。美国专利No.5411874描述了向发酵液中加入福尔马林溶液杀菌，加入十二烷基硫酸钠(SDS)使荚膜脱落，后经一次过滤、一次超滤、一次络合和三次醇沉及后得到的HA，蛋白较高约为0.2％(蛋白/HA(g/g))，为化妆品级HA。美国专利No.4157296公开的一种纯化透明质酸的方法包括：用三氯乙酸处理脓链球菌的培养液以除去菌株，然后用有机溶剂使其沉淀。此法通过调节发酵液pH杀菌，但由于也需大量重复使用有机溶剂进行沉淀，导致成本高并且非常耗时。膜技术可纯化HA，但一般均是作为一种辅助分离手段，用于菌体或小分子量去除，仍需有机溶剂进行分离。如美国专利No.4517295、No.4801539等，采用MWCO10000，20000，30000Da超滤膜渗滤去除小分子物质。但美国专利No.6489467描述了一种无须使用有机溶剂，而是通过调节HA的pH至2.5使HA性状改变并使用超滤进行提纯的方法，但滤速很慢很耗时，不利于大规模生产，且HA不宜长期处于pH为2.5环境中，易导致分子量降解。中国专利200610057913.2和200610090586.0也描述了调节HA的pH至3，在电场和磁场的帮助下进行超滤，以加大滤速，同时避免了使用有机溶剂，但是滤速仍然仅为25.8L/(m²·h)，不利于放大。日本专利早期公开No.63-012293描述了一种通过使用大网状阴离子交换树脂(DianionHPA-25、HPA-75、IRA-900、IRA-904)处理含透明质酸的溶液以除去分子量等于或小于1500000Da的低分子量透明质酸及发热物质的方法。韩国专利No.10-2002-0048915描述了发酵液经活性炭处理、芳族吸附树脂处理、超滤作用及乙醇沉淀作用等得到高纯度HA。

然而，无论提取法还是发酵法，在生产过程中都包含了反复的乙醇沉淀和选择性沉淀。工艺路线较长、复杂、费时，成本高；采用较多有机溶剂，易造成二次污染。致使透明质酸的生产成本仍然很高，严重限制了透明质酸应用范围。各种替代方法如采用一些较贵的性能稳定的吸附树脂或离子交换树脂进行除杂，或采用冷冻离心、pH调控、超滤等方法除杂，所得产品纯度高，但HA得率和分子量损失率则因操作步骤多而有所不足，又涉及复杂的处理过程和处理设备，从而加大了生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从微生物发酵液中收集透明质酸的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)对含有透明质酸的发酵液，通过氯代十六烷基吡啶进行络合或通过乙醇进行醇沉；