[发明专利]一种镉螯合物单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种镉螯合物单克隆抗体及其制备方法。镉螯合物单克隆抗体可应用于环境及农畜产品中Cd²⁺残留的检测。

背景技术

镉(Cadmium，Cd)是对人体健康威胁最大的有害元素之一，它属于微毒重金属，被联合国粮农组组和世界卫生组织列为第三个需要优先研究的食品污染物。镉主要危害肾脏和肝脏，可以导致肺水肿、高血压、贫血、骨头软化症和嗅觉减退丧失。误食含镉的化合物可以引起急性中毒，出现恶心、呕吐、腹泻、全身疲乏、肌肉疼痛和虚脱等症；长期食用带有镉的食品，将可引起肌体癌变，引起新生儿畸形。

目前，环境及农畜产品中Cd²⁺残留的检测主要以石墨炉原子吸收分光光度法为主，该方法具有灵敏、准确、选择性好等优点，但该法基本干扰严重，需采用标准添加法，分析时间长，劳动强度大，需要大型仪器设备，分析工作只能在室内实验室进行，费时费力，难以适应当前检测工作的需要。以竞争性酶联免疫法(ELISA)为代表的快速筛选法是免疫学主流技术，快速、成本低，可以大批量检测以金属螯合物为目标的环境样品及农畜产品。

镉离子免疫检测的关键在于镉螯合物特异性单克隆抗体的制备，镉螯合物特异性单克隆抗体制备的关键又在于镉抗原的制备。镉离子带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆的反应，导致动物中毒，因此，可利用特异性的双功能螯合剂螯合重金属离子，形成能被动物免疫系统识别金属-螯合剂的复合物，将之与载体蛋白偶联，能形成完整的免疫原。镉离子属于重金属，能与蛋白质发生强烈的不可逆的反应，导致蛋白质变性，因此，利用单克隆抗体无法直接识别并检测样品中的镉离子，但可以利用螯合剂螯合镉离子，形成能单克隆抗体识别的镉螯合物。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供了一种镉螯合物单克隆抗体。

本发明的另一目的在于提供上述镉螯合物单克隆抗体的制备方法。

本发明还有一目的在于提供一种利用镉螯合物单克隆抗体检测镉离子的浓度的方法。

本发明按以下方案实现该目的。

一种镉螯合物单克隆抗体对镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白和镉金属螯合物具有特异性。

所述抗体与镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物的反应的OD450值为1.527-1.562，与镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白反应的OD450值为0.001-0.029，与BSA反应的OD450值为0-0.001；对Cd-EDTA的交叉反应性为100％，对Pb-EDTA、Zn-EDTA、Hg-EDTA、Mn-EDTA、Cu-EDTA、EDTA的交叉反应性均＜0.05。

本发明镉螯合物单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：

(1)镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素免疫小鼠；

(2)免疫小鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞的融合及培养；

(3)镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白(Cd-ITCBE-BSA)和1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白(ITCBE-BSA)包被酶标板，筛选阳性克隆的杂交瘤细胞；

(4)竞争抑制进一步筛选阳性克隆的杂交瘤细胞；

(5)阳性克隆的杂交瘤细胞移植降植烷处理的BALB/c小鼠制备单克隆抗体。

所述步骤(1)的镉-1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素的制备包括下述步骤：

A、将牛血清白蛋白(BSA)、钥孔戚血蓝素(KLH)分别溶于pH 9.5的磷酸盐缓冲液，浓度为4～6mg/mL；

B、将10mg螯合剂1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于0.1mol/L，pH9.5的磷酸钠缓冲溶液，浓度为18～22mg/mL；

C、按照1∶1的摩尔比，将螯合剂ITCBE和Cd²⁺溶液混合，用氨水调节pH至7.0～8.0，在20～30℃下搅拌反应12～36小时，合成半抗原Cd-ITCBE；