[发明专利]禽流感病毒PCR扩增和杂交检测与分型方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及禽流感病毒的检测与分型方法，尤其是涉及禽流感病毒的PCR扩增和核酸杂交(PCR-杂交)检测与分型的方法，以及禽流感病毒的检测试剂盒。涉及的禽流感病毒包括通用型和H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2等目前主要流行的亚型。

背景技术

禽流感是禽流行性感冒(Avian Influenza，AI)的简称，它由禽流感病毒(AIV)引起。禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科流感病毒属。正粘病毒科中只有一个属，即流感病毒属。根据流感病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(MS)抗原性的不同，将其分为甲、乙、丙三个血清型，一般意义上的禽流感病毒在血清型上属于甲型流感病毒。根据流感病毒血凝素HA和神经氨酸酶NA抗原性的差异，又可将其分为不同的亚型。目前，禽流感病毒有15种特异的HA(H1～H15)和9种特异的NA(N1～N9)。禽流感病毒除可感染人之外，还可以感染许多其他种属的动物，如禽类、猪、马、海豹等。

禽流感病毒属于呼吸道病原体，主要通过呼吸道侵入人体，并随呼吸道分泌物向外传播，侵入另一易感机体引起呼吸道传染性疾病。在野外条件下，流感病毒常从感染禽的鼻腔分泌物和粪便中排出，病毒受到这些有机物的保护极大地增加抗灭活的抵抗力。此外，流感病毒可以在自然环境中，特别是凉爽和潮湿的条件下存活很长时间，在常温下禽流感病毒可以在动物粪便中存活7天。以上这些因素给禽流感的预防控制工作带来极大的困难，目前禽流感预防的重点主要在于早期发现和在流行前的预防。

AIV感染可引起低致病性禽流感和高致病性禽流感，感染后引起感染宿主的临床表现不特异，在禽类感染的前期症状和其他呼吸道传染病如鸡瘟等类似。高致病性禽流感主要表现为：暴发时家禽大批急性死亡，产蛋停止，呼吸道症状，头部、颜面部和颈部浮肿，无毛部皮肤(冠肉髯、脚部)发绀、肿、出血、坏死，白绿色下痢。低致病性禽流感主要表现为：无症状急性感染，死亡率为5％～15％，产蛋率下降5％～50％，呼吸道病变、气管水肿、干酪样渗出物、气囊炎，肾脏肿大、尿酸盐沉着。在人类禽流感所引起的症状和其他呼吸道病毒感染所引起的症状几乎无法鉴别。仅根据禽流感的临诊症状和剖检病变很难确诊，必须进行实验室诊断。

历史上的禽流感在人类社会曾发生过多次全球性大流行，第一次世界大战末期(1918～1919)的流行，导致5亿人患病，死者2000万；1946～1947年、1957～1958年与1968～1969年又曾三度流行于全世界，之后由于传染病的预防和控制体制和机构的不断健全，从而极大程度的控制了禽流感的在人类中的流行。然而对于一些易感宿主，禽流感的发病率仍然居高不下。2005年至今H5N1亚型禽流感疫情在人和禽类宿主的不断爆发对人类社会的经济和文明亦造成了极大的危害。

目前临床上对AIV检测的金标准仍然是鸡胚或MDCK细胞培养分离和血凝实验，其他的检测还有荧光PCR检测、ELISA抗原抗体检测、胶体金抗原检测等方法和试剂盒。金标准的检测方法需要的时间比较长而难于及时的对疫病进行监控；荧光PCR的检测主要由于检测仪器的昂贵和仪器的不普及而不能广泛应用；ELISA和胶体金抗原检测由于方法固有的低灵敏度而不能完全满足疫病防控的需要。

目前尚未有关于禽流感病毒的PCR-杂交检测及分型方法和试剂盒。目前也没有这方面的国家标准。

发明内容

本发明的目的在于提供一种常见禽流感病毒的早期、有效而简便的检测及分型方法，是对AIV的基因组核酸进行PCR反应后利用PCR产物进行核酸杂交，通过酶标记的AIV通用型和亚型特异性探针进行禽流感病毒的检测和分型。涉及的禽流感病毒包括通用型和H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2等目前主要流行的亚型。

本发明所述的一种禽流感病毒PCR扩增和杂交检测与分型方法，包括以下步骤：

a)分析在国际基因数据库GenBank中登录的所有禽流感病毒即AIV基因组全序列，确定针对AIV通用型和AIV主要亚型即H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2亚型的高度保守的特异性核酸序列作为靶序列；

b)针对所述靶序列设计并合成AIV通用型和各主要亚型的特异性引物；

c)针对所述靶序列位于所述引物之间的序列设计并合成AIV通用型和各主要亚型的扑获探针和生物素标记的杂交探针；

d)提取待检样本RNA，在包含所述引物的RT-PCR反应液中进行RT-PCR扩增得到样本cDNA；

e)将所述的生物素标记杂交探针和变性液加入PCR产物中，进行变性反应；