[发明专利]禽流感病毒PCR扩增和杂交检测与分型方法及其试剂盒

权利要求书

1、一种禽流感病毒PCR扩增和杂交检测与分型方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)分析在国际基因数据库GenBank中登录的所有禽流感病毒即AIV基因组全序列，确定针对AIV通用型和AIV主要亚型即H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2亚型的高度保守的特异性核酸序列作为靶序列；

b)针对所述靶序列设计并合成AIV通用型和各主要亚型的特异性引物；

c)针对所述靶序列位于所述引物之间的序列设计并合成AIV通用型和各主要亚型的扑获探针和生物素标记的杂交探针；

d)提取待检样本RNA，在包含所述引物的RT-PCR反应液中进行RT-PCR扩增得到样本cDNA；

e)将所述的生物素标记杂交探针和变性液加入PCR产物中，进行变性反应；

f)将变性产物与杂交液加入包含所述扑获探针的检测条中，进行杂交反应；以及

g)显色和终止反应，通过检测条的显色条带，判断待检样本是否含有禽流感病毒以及确定病毒的分型。

2、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV通用型的靶序列为如SEQ ID No.1所列的核苷酸序列；针对AIV通用型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所列的核苷酸序列；针对AIV通用型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.4所列的核苷酸序列；针对AIV通用型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.5所列的核苷酸序列。

3、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的H1亚型的靶序列为如SEQ ID No.6所列的核苷酸序列；针对AIV的H1亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所列的核苷酸序列；针对AIV的H1亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.9所列的核苷酸序列；针对AIV的H1亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.10所列的核苷酸序列。

4、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的H3亚型的靶序列为如SEQ ID No.11所列的核苷酸序列；针对AIV的H3亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所列的核苷酸序列；针对AIV的H3亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.14所列的核苷酸序列；针对AIV的H3亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.15所列的核苷酸序列。

5、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的H5亚型的靶序列为如SEQ ID No.16所列的核苷酸序列；针对AIV的H5亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所列的核苷酸序列；针对AIV的H5亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.19所列的核苷酸序列；针对AIV的H5亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.20所列的核苷酸序列。

6、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的H7亚型的靶序列为如SEQ ID No.21所列的核苷酸序列；针对AIV的H7亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所列的核苷酸序列；针对AIV的H7亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.24所列的核苷酸序列；针对AIV的H7亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.25所列的核苷酸序列。

7、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的H9亚型的靶序列为如SEQ ID No.26所列的核苷酸序列；针对AIV的H9亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所列的核苷酸序列；针对AIV的H9亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.29所列的核苷酸序列；针对AIV的H9亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.30所列的核苷酸序列。

8、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的N1亚型的靶序列为如SEQ ID No.31所列的核苷酸序列；针对AIV的N1亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.32和SEQ ID No.33所列的核苷酸序列；针对AIV的N1亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.34所列的核苷酸序列；针对AIV的N1亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.35所列的核苷酸序列。