[发明专利]一种生物保鲜菌剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种用于水果蔬菜的生物保鲜菌剂及其制备方法。

技术背景

具有乙烯跃变性的水果如香蕉、草莓、番茄、草莓、桃、苹果等，在果实成熟后到达变软的过程中有乙烯大量产生的过程，因此香蕉、苹果等在长期保存和长期运输的过程中是用包装箱密封包装并在包装箱中加入乙烯抑制剂以达到保鲜目的。

ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸1-aminocyclopropane-1 carboxylic acid)脱氨酶是以植物正常生理过程中乙烯代谢的前体物质ACC为唯一氮源的细菌分泌的水解酶，它能水解ACC，产生α-丁酮酸和氨，阻止植物乙烯生成和释放。Kloepper等研究用ACC脱氨酶处理种子降低种子内的乙烯水平。Monsanto公司的Klee等首先将此酶表达基因转入番茄植物中，获得了转基因的番茄果实，乙烯生物合成的抑制率达97％，从而果实成熟明显延迟，且转基因的番茄能够正常开花结实，其果实在室温下保存期长达4个月。ACC脱氨酶的优势之处在于它破坏ACC，而不是靠反义抑制，因此，它具有通用性，可用于不同的作物，最近Jia等人又从青霉菌Penicillium sp.中得到了ACC脱氨酶，发现它与已发现的假单胞杆菌Pseudomonas sp.及土星汉逊酵母(Hanseunla saturnus)中的ACC脱氨酶分别有50％和54％的同源性。可见自然界中也存在着多种类型的ACC脱氨酶。

虽然转ACC脱氨酶基因技术用于果蔬保鲜已有报道，但转基因食品或多或少的存在着安全问题。因此开发生物保鲜剂，特别是开发在生产和应用中都不产生任何对环境有害的生物保鲜剂尤为重要。

蔬菜、水果生物保鲜剂的研究适应于当前有机食品的要求，国内国外研究的水果、蔬菜生物保鲜剂基本是应用生物产品的提取物质如：植物、动物、微生物的提取物及代谢产物；应用的保鲜原理是：抑菌、成膜保湿、抑制呼吸等，这些保鲜剂种类应确切的说是：生物产品保鲜剂，如大豆、麦糠提取物，微生物发酵液提取物等。应用活菌作生物保鲜的研究现在只注重拮抗微生物对蔬菜水果的产后病原菌的防治。如Korsten L等(1993)从喷洒过、以及未喷洒过化学药剂的荔枝树上，分离得到了3个拮抗细菌，分别为：Bacillusstearothermophilus、B.megaterium和B.licheniformis，离体试验表明，这些拮抗菌能有效地抑制Phomopsis sp.、Pestalotia sp.、Alternaria alternata、Penicillium sp.和7个未鉴定的荔枝采后致病菌，单独使用或混合使用这些拮抗菌，对于减少采后荔枝的腐烂、病害侵染和果实褐变比用热的水溶性苯菌灵的处理效果好。与苯菌灵处理相比较，从油梨(Perseaamericana)上分离得到的拮抗菌B.subtilis对减少荔枝采后果实腐烂更有效。用枯草杆菌控制鳄梨的褐腐病。这些研究中筛选出许多拮抗菌有细菌、真菌、少量链霉菌作为防治果疏采后病害的生防菌剂。但应用具酶活的植物内生细菌抑制植物乙烯生成达到水果和蔬菜保鲜的研究未见有报道。

在蔬菜水果表皮内大量的定植着内生细菌，这些内生细菌一部分种类在长期与植物共生中会依据其内生的条件产生能分解ACC的酶活特性，在自然条件下这些酶活内生细菌的数量较少，发挥抑制乙烯的作用也小。如果能从内生细菌中得到酶活高的、一定数量的、定植性强的菌种并制成菌剂，将有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物保鲜菌剂的制备方法，该菌剂的菌种从植物内生的具有ACC脱氨酶酶活细菌中筛选获得。

所说的生物保鲜菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)果蔬内生酶活菌的获得：取新鲜的乙烯跃变性的果实，表面消毒后取果皮和果肉相连部分，在无菌匀浆器中研磨成浆液，用无菌水稀释，稀释液在富积假单胞菌的PAF培养基中富积培养，富积培养后的细菌转接到以ACC为唯一氮源的ADF培养液中培养，然后稀释分离所有能利用ACC的细菌，并纯化菌株；

(2)定植菌株的筛选：上述(1)得到的菌株用抗利福平标记方法，通过回接再分离选取能在果实或蔬菜植株内部和表面定值7天达10⁵cfu/mL以上的菌株；

(3)具有ACC脱氨酶酶活高的菌株的获得：分别纯化上述(2)筛选到的菌株，测定各个菌株的ACC脱氨酶的酶活，选取酶活单位在0.2U/mg以上的菌株，再经2-3次反复回接再分离和ACC脱氨酶酶活测定，选择其中酶活性和定植性保持不变的菌株即为目标菌株；