[发明专利]产肠毒素金黄色葡萄球菌α－溶血毒素缺失菌株及其构建

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术，具体的说是一种产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株及其构建。

背景技术

基因敲除技术是自80年代末发展起来的一种分子生物学技术，它是一种通过一定的途径使特定的基因定向失活或缺失的技术。随着分子生物学的发展和后基因组时代的到来，这项技术得到了前所未有的发展。利用基因敲除技术，人们不但可以对特定的基因进行定向的改造，而且可以通过该技术来了解未知基因的结构及功能。正因为基因敲除技术的这些优越性，近年来这项技术在微生物基因工程菌的构建方面得到了广泛的应用。

金黄色葡萄球菌溶血毒素是由金黄色葡萄球菌在生长过程中产生的一种外毒素，由α、β、γ、δ四种亚型溶血毒素组成。由于α-溶血毒素能对人和哺乳动物红细胞产生较强的溶血性，因此在临床上被认为是金黄色葡萄球菌致病的主要因素之一。用于医药工业上以金黄色葡萄球菌发酵生产含有效成份肠毒素的抗肿瘤药物中含有α-溶血毒素，因此在临床应用中对人体产生了较强的毒副作用，限制了其医用价值。因此，寻找一种合适的技术方法来构建产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺陷菌株，无疑对提高含肠毒素抗肿瘤药物的医药价值具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株及其构建。本发明根据同源重组的原理，利用基因敲除技术构建相应的基因敲除载体，转化产肠毒素金黄色葡萄球菌，经过筛选验证最终得到了产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株。通过该方法获得的α-溶血毒素缺失型基因工程菌最终不产生α-溶血毒素，但不影响肠毒素的生产。

本发明的第二个目的是提供一种构建上述金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为；

一种产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株，是通过同源重组的方法将产肠毒素的野生型菌株的α-溶血毒素基因缺失后得到的基因工程菌。

所述产肠毒素的野生型菌株为金黄色葡萄球菌，菌种保藏号为：CGMCC0165，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

缺失菌株可按如下步骤制备：

1)利用PCR技术扩增得到α-溶血毒素基因上游同源序列Hla-u和下游同源序列Hla-d，以及替换基因Neor；并将Hla-u、Hla-d、Neor连接得到基因敲除片段Hu-Neor-Hd；

2)将Hu-Neor-Hd片段克隆入载体pMAD，经PCR扩增和酶切验证得到基因敲除载体pMHL-α，然后将pMHL-α载体转化进金黄色葡萄球菌RN4220进行基因修饰；

3)将基因修饰过的基因敲除载体pMHL-α通过原生质体转化导入产肠毒素野生型金黄色葡萄球菌CGMCC0165细胞内，通过培养，筛选得到产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株。

一种产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株的构建方法，可按如下步骤操作：

(1)根据Genbank已公开的金黄色葡萄球菌α-溶血毒素基因序列，设计两对引物，分别为：Hla-uF 5’CGCGGATCCATCGATTACATTT3’，Hla-uR5’CGGAATTCTGAGCTGACTATACGTG3’；Hla-dF5’CTACTCGAGGTATATGGCAATCAAC3’，Hla-dR5’CGCGGATCCCCTCTATAGTGTCATG3’；以产肠毒素的野生型菌株基因组DNA为模板，用引物Hla-uF，Hla-uR进行PCR扩增得到与α-溶血毒素基因上游序列同源的基因片段Hla-u；用引物Hla-dF，Hla-dR进行PCR扩增得到与α-溶血毒素基因下游序列同源的基因片段Hla-d；

(2)根据Genbank中公开的已知新霉素抗性基因序列，设计一对引物：上游引物为5’GGCGGAATTCATGATTGAACAAGATG3’，下游引物为5’ATAGCTCGAGATCTCAGAAGAACTCGTCA 3’；以载体pcDNA3.1为模板，PCR扩增得到新霉素抗性基因Neor；

(3)基因敲除载体pMHL的构建：将以上步骤(1)和(2)中扩增得到的基因片段Hla-u、Neor、Hla-d进行酶切后连接，得到基因敲除片段Hu-Neor-Hd，然后将此连接片段克隆入载体pMAD、转化，经质粒抽提、PCR扩增及酶切鉴定，构建得到基因敲除载体pMHL-α；